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研究生: 林駿達
Lin, Chun Ta
論文名稱: 探討高自組裝性之短胜肽序列對膠原蛋白模擬胜肽摺疊和自組裝性質影響
The Effects of High Self-Assembled Oligopeptides on the Folding and Self-Assembly of Collagen Mimetic Peptides
指導教授: 洪嘉呈
Horng, Jia Cherng
口試委員: 江昀緯
Chiang, Yun Wei
許馨云
Hsu, Hsin Yun
學位類別: 碩士
Master
系所名稱: 理學院 - 化學系
Department of Chemistry
論文出版年: 2015
畢業學年度: 103
語文別: 中文
論文頁數: 98
中文關鍵詞: 膠原蛋白細胞毒性實驗自組裝三股螺旋
外文關鍵詞: Collagen, Cytotoxicity experiment, Self-assemble, Triple helix
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  • 膠原蛋白是哺乳動物中含量最多的蛋白質,目前已廣泛用在生醫材料上。為了增加其結構穩定度和應用性,我們設計並製備膠原蛋白模擬胜肽。主要的構想是將具有高自組裝性質的胺基酸序列當成基底,並接上膠原蛋白序列,合成新的膠原蛋白模擬胜肽,目的是利用高自組裝性質的胺基酸序列來幫助原始的膠原蛋白序列形成更穩定且高階的結構,並探討其抑制其它蛋白質聚集的可能性。
    研究工作分為兩部分,第一部分是接續研究之前本實驗室所設計和製備的胜肽,這些胜肽是由膠原蛋白序列與貝它類澱粉蛋白序列這兩條序列片段所組成的新胜肽鏈。之前的光譜量測顯示,這些合成的新胜肽中,有一些能夠抑制類澱粉蛋白Ab聚集,有一些在TEM下可以觀察到有別於典型膠原蛋白和類澱粉蛋白這兩種蛋白所形成的纖維。故在第一部分,旨在探討這些胜肽鏈是否對於生物神經細胞會產生毒性,鑑定其是否可以成為新的材料或者是具有潛力的抑制藥物。因這些含Ab序列的膠原蛋白胜肽均具細胞毒性,因此在第二部分,我們選用CILFWG 這段胺基酸序列來做研究,將其接於膠原蛋白相關序列(POG)n之胜肽鏈,共合成五段胜肽: CILFWG、CILFWG(POG)7 、(POG)7CILFWG、OG(POG)4CILFWG和 (POG)7。利用可見光紫外光分光光譜儀、TEM、CD來探討新胜肽鏈的結構特性。
    我們由CILFWG(POG)7這段胜肽的實驗結果發現此一具高自組裝性的短序列胜肽除了能夠穩定膠原蛋白摺疊,亦能幫助其自組裝形成大型結構。我們認為CILFWG(POG)7能夠繼續進行其他生物性實驗,來進一步探討其成為新的生物材料之可能性。


    Collagen, the most abundant protein in mammals, has been widely used in biomedical materials. In order to increase the structural stability of collagen, we designed and synthesized the collagen mimetic peptides (CMPs) in which an oligopeptide with a high self-assembly propensity was attached. By this design, we expected that the oligopeptide could stabilize the collagen triple helix and assist their self-assembly into higher order structures.
    Since some of the CMPs containing Ab(16-22) sequence showed the ability to inhibit the aggregation of A protein in our previous studies, in the first part of this study, we further investigated their cytotoxicity by MTT assay. The results indicate that these CMPs are actually toxic to a Neuro cell N2a.
    Therefore, in the second part, we chose another oligopeptide CILFWG as an attachment to CMPs. From this design, we synthesized a series of CMPs : CILFWG(POG)7 , (POG)7CILFWG, and OG(POG)4CILFWG. The collagen peptide (POG)7 and CILFWG peptide were also synthesized for comparison. We used UV-VIS spectroscopy, TEM, and CD to characterize these peptides. The results showed that the oligopeptide could stabilize the collagen triple helices and assist their self-assembly into higher order structures. In particular, this oligopeptide has a more pronounced effect on CILFWG(POG)7 than any other peptide studied. Thus, this oligopeptide could be potentially useful in designing stable collagen assemblies and related biomaterials.

    目錄 中文摘要 I Abstract III 第 1 章 緒論 1 1-1 蛋白質結構簡介 1 1-2 高自組裝性質胜肽鏈(一) : 貝它類澱粉蛋白( -amyloid,A ) 2 1-2-1 模擬 A (16-22) 短胜肽的設計 3 1-3 高自組裝性質胜肽鏈(二) : CILFWG 短胜肽鏈 8 1-4 膠原蛋白簡介 11 1-4-1 膠原蛋白的結構 12 1-4-2 脯胺酸(Pro)和羥脯胺酸( Hyp )如何穩定膠原蛋白 13 1-4-3 膠原蛋白的自組裝 16 1-5 A與膠原蛋白系列胜肽物理特性 16 1-6 固相胜肽合成法( SPPS )介紹 22 1-6-1 將第一個胺基酸接在樹脂上 ( Attachment of First Residue to the Resin ) 25 1-6-2 去保護 ( Deprotection ) 26 1-6-3 活化 ( Activation ) 27 1-6-4 耦合 ( Coupling ) 27 1-6-5 切除 ( Cleavage ) 28 1-7 圓二色光譜儀 ( Circular Dichroism Spectroscopy, CD ) 28 1-8 穿透式電子顯微鏡 ( Transmission Electron Microscope ) 33 1-8-1 原理 33 1-8-2 儀器 34 1-9 研究動機 36 第 2 章 實驗部分 38 2-2 實驗藥品 40 2-3實驗步驟流程 45 2-4 合成 Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OH tripeptide 46 2-4-1 Boc-(2S,4R)-hydroxyproline (1) 之合成 46 2-4-2 Boc-Hyp-Gly-OBn (2) 之合成 47 2-4-3 Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OBn (3) 之合成 47 2-4-4 Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OH (4) 之合成 48 2-5 胜肽合成 50 2-5-1 A 與膠原蛋白系列胜肽之合成 50 2-5-2 CILFWG與膠原蛋白系列胜肽合成 52 2-6 Cleavage、HPLC前預處理與HPLC分離 53 2-7 細胞培養 54 2-7-1 配製細胞培養所需藥品 54 2-7-2 細胞回養 54 2-7-3 細胞繼代 54 2-7-4 細胞計數 55 2-7-5 細胞保存方法 57 2-8 MTT assay 57 2-8-1 細胞校正曲線實驗 59 2-8-2 MTT assay藥品配製 60 2-8-3細胞毒性實驗 61 2-8-4 細胞抑制實驗 61 2-8-5 MTT assay實驗資料處理 61 2-9 Incubation條件 ( CILFWG與膠原蛋白系列胜肽 ) 62 2-9-1 pH 12.0 緩衝溶液配製 63 2-10 CD光譜量測與資料處理 63 2-10-2 變溫CD光譜量測( Thermal Denaturation ) 63 2-10-3 變溫實驗資料處理 63 2-10-4 測量摺疊速率 66 2-10-5 動力學資料處理 66 2-11 穿透式電子顯微鏡量測 67 2-12 可見光紫外光分光光譜儀量測 ( 濁度動力學實驗 ) 67 第3章 實驗結果與討論 68 3-1 第一部分 : A與膠原蛋白系列胜肽之細胞實驗 68 3-1-1 細胞毒性實驗 68 3-1-2 細胞抑制實驗 72 3-2 第二部分 : CILFWG與膠原蛋白系列胜肽之物理性質鑑定 74 3-2-1 在 4 ℃、pH 12之 CILFWG與膠原蛋白系列模擬胜肽結構特性 74 3-2-2 CILFWG與膠原蛋白系列胜肽摺疊速率比較 83 3-2-3在 37 ℃、pH 12之 CILFWG與膠原蛋白系列模擬胜肽結構特性 85 3-2-4 利用穿透式電子顯微鏡觀察CILFWG與膠原蛋白系列胜肽的結構形貌 86 3-2-5 濁度動力學實驗( Turbidity Experiment ) 91 第4章 結論 93 參考文獻( References ) 96 圖目錄 圖 1-1 (A) -helix結構示意圖 (B) -sheet結構示意圖 1 圖 1-2 各種序列之螢光和穿透式電子顯微鏡鑑定結果 3 圖 1-3 (A) A (1-40) 切成十個胺基酸序列為一組時的作用力 (B) A (12-21) 再切成數組胺基 酸序列的作用力 4 圖 1-4 A(16-22) 所形成的纖維 5 圖 1 5 A(16-22) antiparallel結構示意圖 6 圖 1 6 理論計算結果與 MQ-NMR 實驗結果相對照圖 6 圖 1 7 13C-detected 13C/15N REDOR實驗結果 7 圖 1 8 A (16-22) 粉末 XRD 圖譜 7 圖 1-9 CILFWG胜肽far-UV CD光譜 圖 1-10 CILFWG胜肽聚集結構之AFM圖 9 圖 1-11 (A) 短胜肽與 A40 吸附之 SPR 實驗示意圖 (B)(C) Binding affinity(KD)數據圖表 10 圖 1-12 ThT螢光抑制實驗 10 圖 1-13 CILFWG與A40混合物之AFM 圖 1-14 CILFWG細胞實驗(抑制實驗) 11 圖 1 15 蛋白三股螺旋結構之片段 ( PDB ID : 1CGD ):(A) 側面圖示:綠色、 藍色、紫色表示三條 PPII 以右旋方式形成一個三股螺旋。(B) 從 N 端俯視圖,紅色表示 Gly ,因體積小擠在中間,使得膠原蛋白緊密堆疊。 13 圖1 16 (A) Pro 的 C-endo 構形和 Hyp 的 C-exo 構形 (B) Oi-1 和 Ci'的 n* 作用力:C-exo 構形的反式 N-formyl-L-proline methyl ester (左)和反式 N-acetyl-L-proline methyl ester 的軌域圖 (右) 14 圖 1 17 三股螺旋的氫鍵類型:直接氫鍵(左)、以水為媒介聯結羰基氫鍵(中)、以水為媒介聯結羰基和 Hyp 羥基氫鍵(右) 15 圖 1-18 各模擬胜肽與 A 混合 ThT 螢光抑制實驗 18 圖 1-19 模擬胜肽之 ThT 螢光實驗比較 18 圖 1-20 A(POG)7 胜肽TEM影像 圖 1-21 A16-22 胜肽TEM影像 19 圖 1-22 A(POG)7 胜肽和 A16-22 混合液的TEM影像 19 圖 1-23 A(POG)6 胜肽TEM影像 20 圖 1-24 A(POG)6 胜肽和 A16-22 混合液的TEM影像 20 圖 1-25 (POG)7A 胜肽TEM影像 圖 1-26 A(POG)10 胜肽TEM影像 21 圖 1-27 (POG)10A 胜肽TEM影像 22 圖 1-28 固相胜肽合成法之合成步驟 25 圖 1 29 Boc 去保護機制 26 圖 1 30 Fmoc 去保護機制 26 圖 1-31 HBTU活化胺基酸之反應 27 圖 1 32 經活化後之胺基酸與 resin 上已去保護基的胺基酸進行耦合反應 27 圖 1 33 切除試劑的選擇概要 28 圖 1 34 光通過平面極化器 (polarizer) 之示意圖 29 圖 1 35 線性偏極光的偏轉:左圖為線性偏極光通過沒有光學活性的物質,其向量和的軌跡為 圓形;右圖為線性偏極光通過有光學活性的物質,左、右旋圓偏極光的穿透度不同, 產生一個  角度的偏轉,而新向量和的軌跡為橢圓形。E 為電場向量;T 為透射比 率( transmittance )。 30 圖 1 36 圓二光譜儀測量在不同波長範圍與分析的結構 32 圖 1 37 CD 光譜中蛋白質的二級結構資訊 33 圖 1 38 穿透式電子顯微鏡之結構 34 圖 2 1 Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OH 合成流程圖 46 圖 2 2 Boc-(2S,4R)-hydroxyproline (1) 之合成 46 圖 2 3 Boc-Hyp-Gly-OBn (2)之合成 47 圖 2 4 Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OBn(3)之合成 47 圖 2 5 Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OH (4)之合成 48 圖 2-6 細胞計數盤示意圖 56 圖 2-7 細胞計數盤顯微鏡下視野示意圖 56 圖 2-8 MTT與細胞之間的化學反應 57 圖 2-9 細胞校正曲線圖 59 圖 2-10 校正曲線放大圖 60 圖 2-11 CD 變溫實驗得到的熔化曲線 64 圖 3-1 (POG)7系列胜肽和A(POG)6 細胞毒性實驗 (A)(POG)7 (B) A16-22(C) A(POG)7 (D) (POG)7 A (E) A(POG)6 (F) 10 M 濃度的實驗下,各胜肽毒性比較。 70 圖 3-2 (POG)10系列胜肽細胞毒性實驗 (A) (POG)10 (B) A16-22(C)A(POG)10 (D) (POG)10 A (E) 10 M 濃度的實驗下,各胜肽毒性比較。 71 圖 3-3 細胞抑制實驗 (A) A(POG)6抑制實驗 (B) A(POG)10抑制實驗(C) (POG)10抑制實驗 74 圖 3-4 CILFWG和膠原蛋白系列胜肽於4 ℃、pH 12 下測得之Far-UV CD 圖譜 ( X :CILFWG) 75 圖 3-5 (POG)7 於 pH 12、固定226 nm下所測得之熔化曲線 76 圖 3-6 X(POG)7 於 pH 12下、固定226 nm下所測得之(A)熔化曲線 (B)一次微分處理圖 79 圖 3-7 (POG)7X 於 pH 12 下、固定226 nm下所測得之(A)熔化曲線 (B)一次微分處理圖 80 圖 3-8 OG(POG)4X於pH 12下、固定226 nm下所測得之熔化曲線 81 圖 3-9 CILFWG與膠原蛋白系列胜肽於4 ℃、pH =12 下的摺疊動力學圖譜 83 圖 3-10 CILFWG與膠原蛋白模擬胜肽三股螺旋機制示意圖 85 圖 3-11 37 ℃下 CILFWG與膠原蛋白系列胜肽之Far-UV CD 光譜圖 86 圖 3-12 200 X(POG)7 之 TEM圖 87 圖 3-13 200  (POG)7X 之 TEM圖 88 圖 3-14 200  胜肽之 TEM圖 (A) CILFWG (B) (POG)7 89 圖 3-15 CILFWG與膠原蛋白序列胜肽之濁度動力學實驗圖 91 表目錄 表1-1 一些蛋白質不正常摺疊所誘發之疾病 2 表1-2 模擬胜肽熔化溫度整理 21 表1-3 胜肽合成法使用之活化劑與 N 端保護基之結構式 24 表2-1 本研究中合成的A 系列胜肽與膠原蛋白胜肽 50 表2-2 微波固相胜肽合成法的反應條件 51 表3-1 CILFWG模擬胜肽在pH 12 緩衝溶液下的熔化溫度總整理 81 表3-2 CILFWG與膠原蛋白系列胜肽動力學實驗摺疊速率比較 84

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