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研究生: 鄭惟元
論文名稱: 利用電紡之超順磁性纖維束自組裝成組織工程用之3D立體細胞柱
Self-Assembly of 3-D Aligned Cell Rods Using Electrospun Superparamagnetic Yarns for Tissue Engineering Applications
指導教授: 宋信文
Sung, Hsing-Wen
口試委員:
學位類別: 碩士
Master
系所名稱: 工學院 - 化學工程學系
Department of Chemical Engineering
論文出版年: 2009
畢業學年度: 97
語文別: 中文
論文頁數: 63
中文關鍵詞: 靜電紡織氧化鐵C2C12
外文關鍵詞: electrospinning, iron oxide, C2C12
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  • 心肌、平滑肌、骨骼肌、與神經細胞等,在人體內皆為順向性地排列生長。這類細胞在體外進行組織工程的培養時,若能保持同樣的順向形態,將可使細胞表現出接近於體內生長時的正常功能。本研究利用金屬管尖端作為電紡收集端,製備出具有高度順向性的微米纖維束,作為導引細胞順向生長的支架,讓細胞的形態和原生組織更為相似。為了要克服傳統三維細胞培養系統的氧氣與養份質傳阻礙問題,本研究進一步把電紡纖維束和氧化鐵(Fe3O4)奈米粒子結合,製備出具有超順磁性之微米纖維束,將細胞種在纖維束上,藉由外加磁場驅動,將small size的細胞束重組,以得到large scale的三維順向性細胞柱。本研究主要分為兩大部份,第一部分為尋找最佳電紡溶劑組成,並探討纖維束的細胞毒性。由實驗結果得知,六氟異丙醇與二氯甲烷[HFIP/DCM = 75/25 (v/v)]之混合溶劑,為電紡聚乳酸甘醇酸(PLGA)與Fe3O4奈米粒子的最佳溶劑。經由體外培養實驗得知,將老鼠骨骼肌肌母細胞(C2C12 myoblast)種在所製備的PLGA纖維束上,C2C12細胞可正常貼附並順向性生長,且沒有明顯地細胞毒性。第二部分主要是製備出具有順磁性的纖維束,並探討C2C12細胞於此纖維束上分化與增生之情形。由TEM觀察結果得知,超順磁性的Fe3O4奈米粒子,能在PLGA纖維中的均勻分散。由樣品振盪磁測儀(VSM)和超導量子干涉元件(SQUID)等量測結果可證實所製備的纖維束仍具有超順磁性。將細胞種在此順磁性纖維束(含有10% w/w Fe3O4)上,C2C12細胞可被成功誘導成肌小管(myotube)細胞,證實所添加的Fe3O4並不會影響到細胞原來之分化特性。最後,以SEM證實,在磁場的驅動下,small size的順向性細胞束,確實可自組裝成large scale三維細胞柱。進一步以螢光免疫染色證實,能形成緊密黏合的large scale三維細胞柱,是由於相臨細胞間所分泌的fibronectin 和 collagen III 等細胞外間質和黏合蛋白的作用所導致。以上的實驗結果顯示,本研究成功開發出具有超順磁性的纖維束,能在外加磁場驅動下,自我組裝成large scale的三維順向性細胞柱,將來很有潛力應用於肌肉或心肌組織工程修復上。


    目 錄 內容 頁數 摘要 I 目錄 II 圖索引 IV 表索引 VII 第一章 緒論 1.1 前言 1 1.2組織工程介紹 1 1.3三維空間的細胞培養系統 2 1.4生物相容的降解性高分子 3 1.5電紡技術(electrospinning) 4 1.6磁性物質的介紹 10 1.7 C2C12細胞------------------------------------------------------------------12 1.7研究動機與實驗目的 12 第二章 以電紡製備順向性PLGA 纖維束 2.1 研究目的 15 2.2電纺溶液成分之決定 15 2.3細胞實驗 17 2.4四氧化三鐵奈米粒子在HFIP中的分散性試驗結果 21 2.5 四氧化三鐵奈米粒子在二氯甲烷(Dichloromethane,DCM)中的分散性試驗結果 22 2.6以DCM為溶劑的電紡結果 23 2.7不同HFIP/DMC比例對電紡纖維形態影響之結果 23 2.8 PLGA濃度最佳化實驗結果 25 2.9體外細胞相容性測試結果------------------------------------------------26 2.10以螢光顯微鏡觀察纖維束上細胞的LIVE/DEAD結果------------28 2.11以電子掃描顯微鏡觀察纖維束上細胞之結果-----------------------28 2.12結論--------------------------------------------------------------------------29 第三章 超順磁性纖維束於重組3-D順向性細胞柱之應用 3.1 研究目的 30 3.2四氧化三鐵奈米微粒製備 30 3.3 X-Ray Diffraction (XRD) 31 3.4於電紡纖維中摻入四氧化三鐵奈米微粒 33 3.5 PLGA/Fe3O4 纖維束之VSM ( Vibration Sample Magnetometer )測量 33 3.6PLGA/Fe3O4纖維束之SQUID ( Superconducting Quantum Interference Device)測量 35 3.7穿透式電子顯微鏡(Transmission electron microscopy,TEM) 36 3.8以外加磁場影響PLGA/Fe3O4纖維束之初步測試 37 3.9於PLGA/Fe3O4纖維束上植入細胞--------------------------------------39 3.10 Myotube formation--------------------------------------------------------40 3.11 Live/Dead Viability定性分析-------------------------------------------41 3.12細胞柱上細胞均勻度控制-----------------------------------------------42 3.13共軛焦顯微鏡--------------------------------------------------------------43 3.14 X-Ray Diffraction (XRD) 結果-----------------------------------------44 3.15 PLGA/Fe3O4 纖維束之磁滯曲線--------------------------------------45 3.16 PLGA/Fe3O4 纖維束之SQUID測量結果----------------------------47 3.17穿透式電子顯微鏡 (TEM)觀察結果----------------------------------48 3.18以外加平行磁場影響PLGA/Fe3O4纖維束之初步測試結果------49 3.19改變外加磁場使纖維束聚集測試--------------------------------------50 3.20細胞相容性測試-----------------------------------------------------------53 3.21 Tube formation測試結果-------------------------------------------------54 3.22細胞柱上細胞均勻度控制結果-----------------------------------------55 3.23以磁場驅動之細胞柱自我組裝-----------------------------------------55 3.24單根細胞柱之螢光免疫染色結果--------------------------------------56 3.25結論--------------------------------------------------------------------------60 圖索引 圖1-1、常見的生物可降解性高分子 3 圖1-2、電紡裝置示意圖 6 圖1-3、電紡噴射情況,液柱底端距Taylor cone(A) 23mm (前端) (B) 28mm (中端) (C) 33mm (後端) 6 圖1-4、不同黏度的電纺SEM圖 7 圖1-5、各式順向性纖維收集端之示意圖 (a)平行電極 (b)刀鋒 (c)高速滾筒 8 圖1-6、SMCs 在(a)順向性基材 (b)無順向性基材上生長情形- -9 圖1-7、順向性纖維束收集裝置之示意圖 -----9 圖1-8、實驗規劃 14 圖2-1、六氟異丙醇 (HFIP)結構式 15 圖2-2、以電紡裝置製造纖維束情形 17 圖2-3、C2C12 cells 細胞培養 18 圖2-4、6 well plate with ultra low attachment surface效果示意圖 18 圖2-5、細胞培養測試之實驗流程圖------------------------------------------19 圖2-6、Live/Dead Viability的實驗流程圖------------------------------------20圖2.7、SEM前處理流程圖------------------------------------------------------21圖2-8、氧化鐵粒子於HFIP中分層情形--------------------------------------22 圖2-9、氧化鐵粒子於DCM中均勻分散情形 -------------------------------22 圖2-10、(A) 10 wt % (B) 15 wt% 的PLGA in DMC電纺纖維SEM圖----24圖2-11、10 wt % PLGA在不同比例HFIP/DMC的電紡纖維束SEM圖 HFIP/DMC比例 (A) 25/75 (B) 50/50 (C) 75/25-------------------25 圖2-12、不同濃度PLGA之電紡纖維束SEM圖----------------------------26 圖2-13、不同時間點 (A) 6hrs (B) 12hrs (C) 24hrs (D) 72hrs 的細胞團塊在PLGA纖維束上貼附情形-----------------------------------27 圖2-14、細胞團塊在PLGA纖維束上貼附情形(Live/Dead) -----------28 圖2-15、以SEM觀察細胞在PLGA纖維束上貼附情形---------------29 圖3-1、磁性流體----------------------------------------------------------------30 圖3-2、Fe3O4合成流程圖-----------------------------------------------------31 圖3-3、XRD裝置簡圖---------------------------------------------------------32 圖3-4、VSM 裝置示意圖-----------------------------------------------------34 圖3-5、SQUID裝置示意圖--------------------------------------------------35 圖3-6、TEM裝置示意圖------------------------------------------------------37 圖3-7、平行磁場裝置圖------------------------------------------------------38 圖3-8、平行磁場示意圖------------------------------------------------------38 圖3-9、於Fe3O4/PLGA纖維束上植入細胞流程圖----------------------39 圖3-10、Live/Dead 流程圖---------------------------------------------------41 圖3-11、細胞柱上細胞貼附厚度不均之情形-----------------------------42 圖3-12、氧化鐵奈米粒子之XRD繞射圖譜------------------------------44 圖3-13、VSM量測不同比例氧化鐵(A)40wt%(B)20wt%(C)10wt%之纖維束--------------------------------------------------------------------46 圖3-14、SQUID量測FC和ZFC曲線-------------------------------------47 圖3-15、不同氧化鐵粒子濃度之PLGA纖維TEM觀察結果氧化鐵粒子濃度(A) 10 wt % (B) 20 wt % (C) 40 wt % ------------------48 圖3-16、EDX元素分析圖譜-------------------------------------------------49 圖3-17、(A) 超順磁性纖維束受磁鐵吸引 (B) 超順磁性纖維束在平行磁場中靜止情形--------------------------------------------------49 圖3-18、市售強力磁鐵的尺寸與各面磁通密度量測值-----------------51 圖3-19、Fe3O4/PLGA纖維束於外加磁場作用下聚集影片之截圖---52圖3-20、10 wt % 氧化鐵奈米微粒之PLGA纖維束上細胞之Live/Dead --------------------------------------------------------------------------53 圖3-21、以馬血清誘導後第三天和第六天之Live/Dead觀察--------54 圖3-22、細胞在纖維束上培養第三天,均勻貼附情形----------------55 圖3-23、自我組裝大尺寸細胞柱之(A)可見光(B)Live/Dead(C)SEM 圖--------------------------------------------------------------------------56 圖3-24、Fibronectin 與 PI在單根細胞柱上不同深度之螢光表現---57 圖3-25、Laminin 與 PI在單根細胞柱上不同深度之螢光表現-------58 圖3-26、Collagen III 與 PI在單根細胞柱上不同深度之螢光表現---59 表索引 表1-1、目前已被應用的電紡原料與溶劑 5 表3-1、JCPDS Database的Fe3O4和γ-Fe2O3晶面指數-----------------44

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