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研究生： 陳泰吉
Tai-Chi Chen
論文名稱： 黃嘌呤氧化酶兩單體間之交互作用對催化受質機制之探討
Investigation of Cooperative Interaction between the Homodimer Catalytic Subunits of Xanthine Oxidase
指導教授： 黃國柱
Kuo-Chu Hwang
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 理學院 - 化學系
Department of Chemistry
論文出版年： 2005
畢業學年度： 93
語文別： 中文
論文頁數： 118
中文關鍵詞： 黃嘌呤氧化酶 、異位黃嘌呤 、藥物動力學 、電荷效應 、交互作用
外文關鍵詞： xanthine oxidase, allopurinol, cooperativity, enzyme kinetics
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    • 黃嘌呤氧化酶，分子量約為290kDa，為一個均相二聚體
    ( homodimer )。早期研究認為黃嘌呤氧化酶兩個單體之催化能力為各自獨立不受彼此影響的。實驗中發現，當黃嘌呤氧化酶兩個單體其中一個單體之活性位置佔有受質時，所產生應力會造成酵素結構上的扭曲，與不佔有受質之黃嘌呤氧化酶之FAD做比較，其螢光放光位置呈現藍位移現象，並證實佔有受質之單體會造成另一空的活性位置單體內FAD輔酶能階上升，在催化受質時，電荷會回堵在2Fe/2S clusters能階上。另外，兩單體內其中一個佔有抑制劑，另一個有空活性位置之單體內輔酶以還原態存在時，則會加快被抑制之單體中之抑制劑之解離。
    本研究除了推翻過去五十年來黃嘌呤氧化酶兩單體間無交互作用，發現其存有相當強的交互作用，且以電子順磁共振光譜、旋光光譜、螢光光譜、紫外-可見光光譜法證實，所提出之新模型概念，即當受質佔有其中一個活性單體時，會使另一個空的活性單體內部輔酶FAD能階上升，使2Fe/2S clusters為最低能階。此概念除了瞭解抑制劑與黃嘌呤氧化酶結合後，長時間其催化受質的後續反應機制，也合理解釋先前文獻不合理的現象，以及為何高濃度受質可調控黃嘌呤氧化酶活性，使其催化能力與對受質之親和力變差。

    摘要…………………………......……………........…….…....I 目錄…………………………………………………………..........II 圖目錄………………………………………………………….…......V 表目錄………………………………………………………..........XI 第一章 前言……………………………………………………….....01 1-1研究起源………………….……………………...……….....…01 1-2研究目的………………………………………………..….………02 第二章 文獻回顧…………………………………………………….…03 2-1 交互作用（cooperativity）…………………………….……..03 2-2 普遍用於探討酵素動力學之模型( M-M )……………………...04 2-3 酵素活性調控……………………………………………….…...08 2-4異位調節酵素……………………………………………...……..11 2-5 異位性質之動力學……………………………………………....12 2-6常見之異位酵素…………………………………………...……..14 2-7黃嘌呤氧化酶簡介………………………………………...……..17 2-7-1黃嘌呤氧化酶之結構…………………...………………….17 2-7-2黃嘌呤氧化酶之催化……………………….……………...20 2-7-3黃嘌呤氧化酶催化機制之研究…………………………....21 2-8黃嘌呤氧化酶內部電子傳遞之研究……………………………….25 2-8-1黃嘌呤氧化酶內部電子傳遞之EPR研究…………………..25 2-8-2黃嘌呤氧化酶內部電子傳遞速率之研究………………….27 2-9 ”受質-抑制作用”與”受質-活化作用”………...………...28 2-10黃嘌呤氧化酶之相關疾病………………………………….…….30 2-11黃嘌呤氧化酶之抑制劑……………………….….…………....36 第三章 實驗原理與方法……………………………………………….43 3-1實驗藥品清單……………………………………...……………..43 3-2酵素純化原理與步驟………………………...…………...…...44 3-2-1純化原理…………………………………….……..……….44 3-2-2純化黃嘌呤氧化酶之原理…………………….…………..…..47 3-2-3黃嘌呤氧化酶純化步驟………………….………………..…..50 3-3除氧方式與原理…………………………………………………….51 3-4黃嘌呤氧化酶濃度與活性測定方式………………………...…..52 3-5製備不同當量數之異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體之步驟…..53 3-6受質的簡介………………..……………………………………...55 3-7螢光光譜實驗條件………………………………………………….58 3-8電子順磁共振光譜儀測量.................................58 3-9旋光光譜儀測量…………………………………………………….59 3-10測量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體連續反應之解離常數...60 3-10-1連續反應………………………….......…………………...60 3-10-2測量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體之解離常數...…....61 3-10-3測量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體催化6FP之k3’…....63 第四章 實驗結果與討論……………………………………………….64 4-1異位黃嘌呤對黃嘌呤氧化酶之交互作用………………………….64 4-1-1異位黃嘌呤對黃嘌呤氧化酶輔酶FAD能階之影響………......64 4-1-2高濃度受質對黃嘌呤氧化酶輔酶FAD能階之影響………......76 4-2測量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體（E2I2）之解離常數…..80 4-3黃嘌呤氧化酶單體間之交互作用對受質催化之影響………..….87 4-3-1異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體對受質催化之影響……....87 4-3-2高受質濃度對黃嘌呤氧化酶之催化影響………………….....91 4-4電荷效應對異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體催化受質之影響..94 4-5電荷對異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶之異位黃嘌呤解離影響…...101 4-6新模型概念與文獻探討…………………………...…………...106 第五章 結論………………………………………………….....….112 參考文獻………………………………………………………….....114 圖目錄 圖2-2.1遵守M-M模型的酵素，催化速率對受質作圖………………..06 圖2-2.2 Lineweaver-Burk plot….………………….…..………..07 圖2-3.1酵素的抑制模式…..………………………………………...09 圖2-5.1異位抑制劑存在下，受質飽和曲線呈S型………………....12 圖2-5.2氧氣鍵結血紅素之Hill plot ……………………….......13 圖2-6.1 ATCase的異位效應與其次單元位置圖….……..…….....15 圖2-6.2磷酸化酶 T 型之調節區Ser-p 與AMP之位置圖…………...16 圖2-7.1黃嘌呤氧化酶，A:酵素結構；B:酵素內各輔酶位置圖…….18 圖2-7.2黃嘌呤氧化酶輔酶之間距離……………….…...………….18 圖2-7.3羥基化反應……………….……………………………………20 圖2-7.4為黃嘌呤（xanthine）受XOD之催化形成尿酸示意圖……..20 圖2-7.5黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤電子傳遞示意圖...............21 圖2-7.6黃嘌呤氧化酶氧化還原態光譜圖...………………………..22 圖2-7.7 Mo-pt 輔酶結構圖……...………………………………….23 圖2-7.8黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤之機制……………………......24 圖2-7.9黃嘌呤氧化酶之不同型態之結構..…………………......24 圖2-8.1黃嘌呤氧化酶輔酶還原態之EPR訊號….……….………...26 圖2-8.2黃嘌呤氧化酶之各輔酶速率常數圖…...………………...28 圖2-9.1 黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶之Lineweaver-Burk圖……..…….29 圖2-9.2 黃嘌呤與黃嘌呤脫氫酶之Lineweaver-Burk圖.………....29 圖2-10.1 purine合成路徑……..…………………………………...31 圖2-10.2黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤生成尿酸…………..…………..32 圖2-10.3 PRPP的合成，促進與抑制因子…………………………...33 圖2-10.4缺血再灌流傷害的生成路徑與抑制方式……….….....…36 圖2-11.1黃嘌呤氧化酶抑制劑之主要結構………………………....36 圖2-11.2異位次黃嘌呤與酵素催化之反應………….……………….37 圖2-11.3 EXAFS測得之alloxanthine 與XOD之抑制錯合物結構…..38 圖2-11.4異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體電子吸收光譜………….39 圖2-11.5黃嘌呤氧化酶與一系列pyrazolo[3,4-d]pyrimidine相似物產生酵素-抑制劑複合體的電子吸收光譜……………..….…......39 圖2-11.6為葉酸經由光照所產生之6FP…………………………….…41 圖2-11.7 6FP經催化之產物6CP圖…………………………………...41 圖3-2.1膠體過濾法…………………………………………….………45 圖3-2.2親和層析法…………………………………………………….46 圖3-3.1除氧示意圖…………………………………………………….52 圖3-4.1黃嘌呤轉變為尿酸，電子吸收光譜變化………………...…53 圖3-5.1製備0.8當量之異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體示意圖.…54 圖3-5.2 製備1當量之異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體示意圖…..55 圖3-10.1 連續一級反應曲線圖………………………………...…..61 圖3-10.2有氧環境下，0.8當量之異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體與6FP之吸收光譜………………………………………………………….63 圖4-1.1有氧環境下，不同當量之異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體之螢光光譜圖……………………..……………………………………..65 圖4-1.2在無氧環境下，一當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體螢光強度隨時間之變化…………………………………………..………..68 圖4-1.3有氧環境下，0.76當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體隨時間解離之吸收光譜圖……………………………………………………69 圖4-1.4 一當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體解離一小時後，8K之EPR圖.…………………………………………………………………71 圖4-1.5有氧環境下，一當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體隨時間增長其旋光光譜變化…………………………..……………………..73 圖4-1.6異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體內輔酶之還原電位示意圖……………………………………...……………………………...75 圖4-1.7黃嘌呤氧化酶加入1.3 mM濃度受質之螢光光譜圖…….....77 圖4-1.8有氧環境下，黃嘌呤氧化酶外加受質均勻混合30秒之前後吸收光譜變化…………… ……………………………………………….78 圖4-1.9有氧環境下，黃嘌呤氧化酶外加不同當量數受質在吸收波長450 nm、550 nm，測量反應前30分鐘其吸收值變化…………………79 圖4-2.1異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體解離之FAD螢光光譜特徵.81 圖4-2.2螢光光譜法，1eq異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體解離...83 圖4-2.3異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體解離之吸收光譜特徵…..84 圖4-2.4吸收光譜法，一當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體解離84 圖4-2.5 (A)吸收光譜法，一當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體450, 550 nm吸收變化 (B) 1eq XOD-alloxanthine 室溫解離兩小時後8K之FADH . EPR訊號………..……………………………....……87 圖4-3.1室溫有氧環境下，0.74當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體外加相對酵素之活性位置之有效濃度1當量6FP吸收變化圖………………………………..……………………………………..89 圖4-3.2有氧室溫環境下，異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合物催化受質之k3, , k3’……………………………………………………………90 圖4-3.3有氧室溫環境下，異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合物外加大量受質之活性恢復圖………………………………………………………91 圖4-3.4有氧室溫環境下，黃嘌呤氧化酶催化受質之k3 , k3’’…92 圖4-3.5有氧室溫環境下，黃嘌呤氧化酶外加1.3 mM之受質一小時催化之產物吸收變化……………………………………………………..94 圖4-4.1室溫無氧環境下，反應前一小時0.74當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體外加相對此濃度不同當量數xanthine，再加入1eq 6FP所得之吸收變化光譜圖…………………………………………………96 圖4-4.2室溫無氧環境下，反應前一小時0.74當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體其反應等吸收點（400 nm）對時間作圖………………97 圖4-4.3無氧環境下，0.74當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶外加不同當量xanthine形成不同還原態輔酶對6FP催化k’3（e）與half-time.98 圖4-4.4有無氧環境下，黃嘌呤氧化酶九小時之活性衰退情形.....99 圖4-4.5有無抑制劑之黃嘌呤氧化酶複合體催化6FP之k3， k’3， k’3(e)…………………………………………………………………100 圖4-4.6 0.74當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體外加相對其有效活性濃度一當量6FP與不同當量數xanthine測量之k3’，k’3(e)………………………………………………………………………...100 圖4-5.1無氧下0.74當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體外加相對其有效活性濃度1, 3當量數xanthine，隨時間增長其催化反應之ΔA295nm吸收變化……………………………………………………….103 圖4-5.2有氧環境下，0.8當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合體外加相對其有效活性濃度0, 1, 1.5, 2.5, 3, 4當量之xanthine，在550 nm與450 nm時間對吸收變化圖……………………………………….105 圖4-6.1 ( A )之xanthine ( 200 μM ) / alloxanthine ( 200 μM )與XOD ( 200 nM )反應之產物(尿酸)吸收變化值（△A 294 nm）與( B ) allopurinol ( 200 μM )與 XOD( 200 nM )反應之產物(異位黃嘌呤)吸收變化值（△A 277 nm）對時間作圖………………..110 圖4-6.2 黃嘌呤氧化酶催化不同受質之Km………………………….111 圖4-6.3 黃嘌呤氧化酶催化xanthine與allopuriol之示意圖…….111 表目錄 表2-7.1黃嘌呤氧化酶各輔酶圖……………….……………….….. 19 表2-8.1黃嘌呤氧化酶與相關酵素各輔酶還原電位……….…….….27 表2-10.1尿酸排泄促進劑與生合成抑制劑之使用量…………......34 表2-10.2痛風患者併發症……………………………………………..35 表2-11.1 Allopurinol之副作用……………………………….….…40 表3-1.1實驗藥品……………………………………………….…….43 表3-2.1 EAH-SepharoseTM4B/folate gel親和管柱的製備流程……47 表3-6.1各受質的最大吸收波長，吸收係數………………………….56 表3-6.2 黃嘌呤氧化酶與受質測量反應之實驗條件………………..57 表3-7.1螢光光譜實驗參數…………………………………………...58 表3-8.1 EPR實驗參數………………..……………………….………59 表3-9.1旋光光譜實驗參數…………………………………………….59 表4-1.1、受質與黃嘌呤氧化酶產生FAD放光藍位移與其能階差…..78 表4-3.1、異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶複合物催化受質之k3、 k3’…………………………………………..…………….……………….90 表4-3.2黃嘌呤氧化酶催化受質之k3, k3’’……………………….92 表4-4.1無氧下0.74當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶，加入不同當量數之xanthien產生不同還原態輔酶其對6FP催化之k’3（e）…………98 表4-5.1無氧室溫下，0.74當量異位黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶，加入不同當量數xanthine，存放0,5小時後，測其反應之差異………………104 表4-6.1有氧環境下，黃嘌呤氧化酶外加大量受質之還原態輔酶EPR之訊號………………………………………………………………….…108

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