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研究生： 吳毓婷
Wu, Yu-Ting
論文名稱： 利用In vitro selection篩選DNA型藥物與其和日本腦炎病毒封套蛋白第三區塊交互作用之研究
In vitro selection and characterization of DNA aptamer targeting the domain III of Japanese encephalitis virus envelope protein
指導教授： 程家維
Cheng, Jya-Wei
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 生命科學暨醫學院 - 生物科技研究所
Biotechnology
論文出版年： 2009
畢業學年度： 97
語文別： 中文
論文頁數： 72
中文關鍵詞： 日本腦炎病毒
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    • 日本腦炎(Japanese encephalitis virus, JEV)係感染日本腦炎病毒引起的急性腦膜腦炎，大約五百個病例中會有一個嚴重個案會惡化成腦炎，其被視為是造成人類致病率跟死亡率的重要病原體，世界衛生組織(The World Health Organization)估計全球每年有超過五萬件日本腦炎事件發生！雖然近年來台灣地區日本腦炎的感染有下降的趨勢，但每年仍然有報告的病例。儘管日本腦炎衝擊著醫療及公共衛生，對於這類感染，在化學預防和化學治療中，卻無有效的藥物。
    套膜E醣蛋白(envelope protein；E protein)為主要的中和性單株抗體(neutralizing antibodies)所辨認之區域，且在病毒入侵後所引發的免疫反應機制及病毒的附著、融合和穿透的機制中，扮演著重要的角色。 日本腦炎病毒也被認為是利用封套蛋白E和細胞表面接收器鍵結而引發細胞吞噬作用(receptor-mediated endocytosis)作為感染細胞的開始，所以藉由研究日本腦炎病毒外套膜蛋白與宿主細胞膜上的接受器之間的結合機制，可以進而設計抑制病毒進入細胞的藥物或疫苗。
    在此，我們利用SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)的技術，從DNA library篩選出對日本腦炎病毒有高親和性及專一性的序列，序列中大部分都包含 CCAACGCAAGCACCATCG的序列區段；並利用螢光光譜儀測量S18對JEV的鍵結常數，為66.3 nM；以及測試S18的穩定度。研究果並顯示出所篩選出的S18有效抑制日本腦炎及登革熱病毒的感染。因此，S18是具有潛力成為抗病毒的藥物。

    第一章 序論 4 第一節、黃熱病毒(Flavivirus) 4 第二節、日本腦炎(Japanese encephalitis virus) 5 第三節、日本腦炎病毒特結構特性 8 第四節、Class ΙΙ fusion 10 第五節、日本腦炎病毒感染細胞機制 11 第六節、SELEX (Systematic Evolution of Lgands by EXponential enrichment)簡介 14 第二章、研究目標 16 第三章、實驗方法與材料 17 第一節、蛋白質表現以及純化 17 1.1 未標定蛋白質 17 1.2 15N標定蛋白質 17 1.3 Inclusion body的製備 18 1.4 蛋白質純化 19 1.5 SDS-PAGE分析 20 第二節、 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 21 2.1 基本原理 21 2.2 實驗方式 22 2.3 DNA electrophoresis/ Agarose gel electrophoresis 23 第三節、基因選殖 (Cloning) 24 3.1 competent cell製成 24 3.2 Ligation 25 3.3 bacterial transformation 25 第四節、光電比色儀(Spectrophotometer) 25 4.1 基本原理 26 4.2 實驗方式 26 第五節、螢光光譜儀(Fluorescence Spectrometer) 27 5.1 基本原理 27 5.2 樣品製備 29 5.3 實驗方式 29 第六節、The degeneration time of S18 with serum 30 6.1 實驗方式 30 第七節、Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT) 30 7.1 基本原理 30 7.2 實驗方式 32 Plaque puritication 32 第四章、實驗結果與討論 34 第一節、日本腦炎病毒 E292-402蛋白質的表現與純化 34 第二節、SELEX selection of ssDNA ligands for JEV using random ssDNA pool. 35 第三節、Dissociation constant (Kd) determination for JEV and DEN with S18 36 3.1 JEV和S18之間的鍵結螢光實驗 36 3.2 DEN和S18之間的鍵結螢光實驗 37 第四節、S18的穩定性 37 第五節、Inhibition of virus infection by S18 in vivo 37 5.1 Inhibition of DENV infection 38 5.2 Inhibition of JEV infection 38 第六節、結論 38 第五章、討論 39 References 40 圖表 43 Table 1.Sequence alignment of the random region of selected aptamers. 43 Table 2. Dissociation constant (Kd) determination for JEV and DEN with S18 44 圖1-1 日本腦炎感染區域的分佈圖 45 圖1-2 日本腦炎病毒的RNA與轉譯的蛋白質示意圖 46 圖1-3 登革熱病毒E蛋白結構 47 圖1-4 The dengue sE trimer 48 圖1-5 Proposed mechanism for fusion mediated by class II viral fusion proteins 49 圖1-6 各種不同的GAGs的結構 50 圖1-7 Flowchart of SELEX procedure in ssDNA 51 圖3-1 The promoter and multiple cloning sequence of the pGEM®-T Easy Vectors 52 圖3-2 pGEM®-T Easy Vector circle map and sequence reference points 53 圖4-1 E292-402 DNA sequence、E292-402 Protein sequence 54 圖4-2 JEV E domain蛋白質純化的SDS-PAGE圖 55 圖4-3 Predicted secondary structures of the selected ssDNA ligands 58 圖4-4 SELEX selection of ssDNA ligands (round 1~15) 59 圖4-5 JEV與DNA (S18)的鍵結作用之螢光光譜圖 60 圖4-6 DEN與DNA (S18)的鍵結作用之螢光光譜圖 61 圖4-7 The degeneration time of S18 with serum 62 圖4-8 Inhibition of DENV infection by S18 in vivo 63 圖4-9 Inhibition of JEV infection by S18 in vivo 64

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