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研究生: 劉得宇
Liu, Te-Yu
論文名稱: 利用奈米金陣列增強拉曼訊號應用於單一病毒檢測
Array of nano-gold using surface enhancement Raman scattering applied to single virus detection
指導教授: 曾繁根
Tseng, Fan-Gang
口試委員: 魏培坤
Wei, Pei-Kuen
徐文祥
Su, Wen-Syang
張晃猷
Chang, Hwan-You
王本誠
Wang, Pen-Cheng
學位類別: 碩士
Master
系所名稱: 原子科學院 - 工程與系統科學系
Department of Engineering and System Science
論文出版年: 2011
畢業學年度: 99
語文別: 中文
論文頁數: 88
中文關鍵詞: 微系統光學免疫感測晶片奈米金陣列螢光訊號拉曼訊號
外文關鍵詞: MEMS, Optical immune sensor chip, Nano Au array, Fluorescence signal, Raman signal
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  • 本研究針對奈米光學免疫感測晶片的研究,可應用於醫學、生化相關的檢測,利用特殊的奈米結構,可以讓訊號增強,達到快速篩檢的功用。本研究內容包含奈微米金陣列結構製作技術、化學合成粒子表面結構技術、表面化學修飾技術以及螢光訊號與拉曼訊號測試技術等。
    生物檢測晶片已經研究多年,但是要達到少量的檢體又能快速並且明顯的得到高照訊比的目標一直是這方面研究的課題,近年來有許多人在研究特殊的奈米結構用以增強拉曼訊號,若能夠利用上述之方法,將可以減少檢驗物質並且提高訊號。而前述的奈米光學免疫感測晶片,是利用金屬粒子表面修飾一層自組裝單分子膜,再用單分子膜上面官能基與抗體官能基鍵結,抗體與抗原之間有互相辨認的特性,達到感測的機制。
    為了滿足量少又能使訊號增強的需求,本研究設計了一種三維奈米等級的粗糙表面結構,搭配不同參數條件,可有效增加其訊號,由拉曼光譜檢測結果亦可獲得驗證。利用腺病毒當我們檢測的檢體,在結果方面,利用濃度107/μl的病毒溶液,有結構拉曼訊號增加為沒有結構的五倍,因此,透過此技術,不但有效減少檢體的量,並且有助於拉曼訊號之提升。


    Abstract
    In this study, optical immune sensor chip can be used in medicine, biochemistry related to the detection, the use of special nano-arrays, allowing the signal enhancement, to achieve rapid screening function. This study includes nano-micron manufacturing technology of gold array structure, chemical synthesis of particles, surface chemical modification techniques and fluorescence signals and Raman signal testing technology.
    Biological detection chip has been studied for many years, but a small number of samples to achieve can be fast and clear signal that we need research in this area has been subject in recent years, many people in the study of nanostructures for specific enhanced Raman signal, if able to use the above method, can reduce the test material and to increase the signal. The aforementioned nano optical immune sensor chip is a layer of surface modification by metal particles self-assemble monolayer, monolayer and then the above functional groups and the antibody binding functional group, each between antibody and antigen identification features achieve sensing mechanism.
    In order to increased the signal and less target in our chip, the study design was a three-dimensional rough surface structure level, with different parameters, which can effectively increase the signal detected by the Raman spectroscopy results can be verified, Therefore, through this technology, not only effectively reduce the amount of samples, and help enhance the Raman signals.

    總目錄 摘要 i Abstract ii 致謝 iii 總目錄 iv 圖目錄 ix 表目錄 xiv 第1章 緒論 1 1.1 前言 1 1.2 研究動機 3 1.3 研究概念 4 第2章 文獻回顧 8 2.1 生物檢測方法 8 2.1.1 ELISA 9 2.1.2 PCR 13 2.1.3 光學免疫感測晶片 14 2.2 奈米金陣列 15 2.2.1 奈米結構製程方法 16 2.3 硫醇自組裝分子薄膜的形成機制 20 2.3.1 自組裝單分子膜的定義 21 2.3.2 SAM成膜過程[24] 22 2.4 光學檢測方法 24 2.4.1 拉曼光譜 (Raman spectroscopy) 24 2.4.2 拉曼散射機制 25 2.5 表面增強拉曼散射(SERS) 27 2.5.1 物理機制[27][28] 28 2.5.2 化學機制(第一層效應) 30 第3章 實驗設計與規劃 33 3.1 實驗設計與架構 33 3.1.1 奈米金粒子陣列製程 33 3.1.2 奈米金粒子表面結構改良 36 3.1.3 表面化學修飾與螢光蛋白修飾 37 3.1.4 表面形貌與光學檢測 38 3.1.5 腺病毒之檢測 38 3.2 實驗流程設計 39 3.2.1 晶片製作 39 3.2.2 腺病毒檢測 39 3.3 實驗藥品、材料與儀器 40 3.3.1 化學藥品 40 3.3.2 實驗材料 43 3.3.3 實驗檢體 44 3.3.4 實驗儀器 44 第4章 實驗步驟 53 4.1 晶片製作 53 4.1.1 試片清潔 53 4.1.2 電子束微影製程 53 4.1.3 電子束蒸鍍製程 54 4.1.4 光阻掀離製程 55 4.1.5 金薄膜退火 56 4.1.6 金球表面結構改良 56 4.1.7 硫醇自組裝單分子修飾 58 4.1.8 活化自組裝單分子表面 58 4.1.9 螢光蛋白修飾 58 4.1.10 掃描式電子顯微鏡表面結構分析 59 4.1.11 螢光發光強度之分析及比較 59 4.1.12 拉曼光譜檢測分析及比較 60 4.2 腺病毒檢測 60 4.2.1 濃度定量 60 4.2.2 電子束微影 61 4.2.3 晶片測試 62 4.2.4 腺病毒抗體修飾 62 4.2.5 病毒檢測 62 4.2.6 光學檢測 63 第5章 結果與討論 64 5.1 晶片製作 64 5.1.1 奈米金球陣列 64 5.1.2 表面化學合成 66 5.1.3 螢光蛋白修飾 67 5.1.4 拉曼訊號 70 5.2 腺病毒檢測 71 5.2.1 電子束微影 71 5.2.2 晶片測試 73 5.2.3 抗體修飾 74 5.2.4 拉曼訊號 76 第6章 結論 81 6.1 晶片製作 81 6.2 腺病毒檢測 82 第7章 總結 84 參考文獻 85 圖目錄 圖 1 1 利用奈米粗糙粒子增加表面拉曼散射 4 圖 1 2 試片製程示意圖[13] 5 圖 1 3 不同的濃度條件下,電化學合成之結果[14] 6 圖 1 4不同表面粗糙度的結構對覆蓋率與雜交效率的影響[14] 6 圖 1 5 HAuCl4與HEPES化學合成之結果[15] 7 圖 2 1 ELISA過程示意圖 11 圖 2 2 免疫分析法示意圖[16] 12 圖 2 3 PCR過程示意圖 14 圖 2 4 SAMs 形成機制之示意圖。(A)表面分子為低濃度,分子極易移動;(B)當吸附的量增至某臨界值時,開始有較強的分子與表面之作用力,開始形成條紋狀結構;(C)條紋狀結構漸增至飽和;(D)開始形成站立之區塊,亦即由solid1 到solid2 之相變化;(E)表面分子密度增加,使得條紋狀之結構完全消失,並轉變為站立之(√3x√3)R30o。 23 圖 2 5 拉曼散射機與雷利散射機制圖 25 圖 2 6電磁波與簡諧振子之拉曼散射示意圖。其入射光子能量小於電子躍遷能量,因此稱吸收光子能量之分子為虛態(Virtual),以虛線表示。h 為普朗克常數,νL為入射光頻率,νM為分子振盪頻率,νaS為反史托克斯散射頻率,νS為史托克斯散射頻率。 26 圖 2 7史托克斯與反史托克斯光譜示意圖,縱軸為強度單位 26 圖 2 8 電磁波影響球體震盪示意圖[26] 27 圖 2 9 金屬團簇與SERS示意圖 30 圖 2 10 金屬球與分子之電磁強化示意圖 30 圖 3 1 AuCl4-溶液(0.5mM)與不同濃度的HEPES:(A和B)15mM、(C和D)20mM與(E和F)40mM合成的奈米金粒子SEM與TEM圖,A和C的小圖表為粒子大小的分布圖。[15] 36 圖 3 2 (A)使用0.2mM的AuCl4-溶液與40mM的HEPES合成金粒子之SEM圖,(B)不同的HEPES/HAuCl4比值所形成的奈米粒子表面[15] 37 圖 3 3 (A)不同時間形成的奈米粒子的吸收光譜圖(B)奈米粒子在不同時間的形成大小(C)奈米粒子形成之機制示意圖[15] 37 圖 3 4 實驗流程圖 39 圖 3 5利用奈米金陣列檢測腺病毒示意圖 40 圖 3 6 Spin Coater 44 圖 3 7 電子束微影系統 45 圖 3 8 反應試離子蝕刻機 46 圖 3 9電子槍蒸鍍機 46 圖 3 10 高溫爐管 47 圖 3 11 磁石攪拌器 47 圖 3 12 PH meter 48 圖 3 13 電子秤 48 圖 3 14 Shaker 48 圖 3 15 場發射掃描式電子顯微鏡 49 圖 3 16 (A)光學顯微鏡系統(B)顯微鏡(C)TIRF專用物鏡(D)488雷射槍 50 圖 3 17 高解析共焦拉曼顯微鏡光譜儀 51 圖 4 1 電子槍蒸鍍機與試片示意圖 55 圖 4 2 金薄膜退火成金球之示意圖 56 圖 4 3 化學合成架設示意圖 57 圖 4 4電子束微影示意圖 61 圖 4 5 試片測試示意圖 62 圖 5 1 不同的曝光參數的光阻顯影SEM圖 65 圖 5 2顯影過後之圓洞陣列圖與退火過後之金球陣列圖 65 圖 5 3 表面化學合成SEM圖 66 圖 5 4左圖為合成後溶液的UV吸收光譜和右圖文獻[15]吸收光譜比較 67 圖 5 5 左圖為OM圖,右圖為螢光圖 67 圖 5 6 改善背景值之細節流程圖 68 圖 5 7 改善後的比較圖,左圖為OM圖,右圖為螢光圖 68 圖 5 8改善前與改善後的亮度比較 69 圖 5 9 光滑表面(左)與粗糙表面(右)之SEM圖 69 圖 5 10 光滑表面(左)與粗糙表面(右)之螢光圖 70 圖 5 11光滑表面與粗糙表面的螢光亮度比較圖 70 圖 5 12 光滑表面與粗糙表面的螢光蛋白拉曼訊號比較 71 圖 5 13文獻中螢光蛋白的拉曼訊號[33] 71 圖 5 14不同間距與密度的球陣列SEM圖(10kX) 72 圖 5 15不同間距與密度的球陣列SEM圖(50kX) 73 圖 5 16晶片測試示意圖 73 圖 5 17 R6G的拉曼訊號圖,左圖為本實驗的晶片訊號圖,右圖為文獻[34]中拉曼訊號圖 74 圖 5 18 腺病毒的拉曼訊號圖,左圖為本實驗的晶片訊號圖,右圖為文獻[35]中拉曼訊號圖 74 圖 5 19接上腺病毒上體,左圖為光學顯微鏡影像,右圖為螢光顯微鏡影像 75 圖 5 20不同間距與密度的金球陣列修飾螢光抗體之螢光圖 75 圖 5 21病毒在不同間距與密度的金球陣列拉曼光譜圖比較 76 圖 5 22不同濃度與拉曼強度的比較圖 78 圖 5 23利用拉曼光譜做直線上的掃描(A)為實際CCD拍攝圖(B)為橫截面示意圖(C)為選擇1457cm-1的峰值與移動距離做圖 79 表目錄 表 2 1 不同檢驗方式之比較圖 15 表 3 1 不同基材的特性比較 34 表 3 2 各種電子束微影之光阻 35 表 4 1 ZEP520A電子束光阻塗佈參數 54 表 4 2 反應是離子蝕刻機製程相關參數 57 表 4 3 OD260定量表 61 表 5 1病毒在不同間距與密度的金球陣列拉曼光譜數據表 77

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