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研究生： 陳媛婷
Yuan-Ting Chen
論文名稱： 超臨界流體萃取基因重組後大腸桿菌中蕃茄紅素之研究
指導教授： 凌永健
Yong-Chien Ling
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 理學院 - 化學系
Department of Chemistry
論文出版年： 2008
畢業學年度： 96
語文別： 中文
論文頁數： 87
中文關鍵詞： 超臨界流體 、蕃茄紅素 、大腸桿菌
外文關鍵詞： supercritical fluid, lycopene, E. coli
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    • 摘要
    由於醫藥進步，人類壽命越來越長，因為老年而衍生的問題益形明顯，因此，抗氧化的健康食品逐漸被國人所重視。目前最熱門的抗氧化健康食品就屬類胡蘿蔔素，而開發超臨界二氧化碳萃取之綠色製程，以超臨界二氧化碳無毒溶劑萃取有效成分，並找出最適化萃取條件，為本論文的重點。第二章及第三章發展基因重組後之大腸桿菌中蕃茄紅素之無毒性綠色製程，以超臨界二氧化碳流體萃取取代傳統有機溶劑萃取，以田口式實驗計劃法系統性地決定超臨界流體萃取蕃茄紅素之實驗參數最佳化組合，並與單一因子實驗法比對確認最適化條件。找出超臨界流體萃取基因重組後之大腸桿菌中蕃茄紅素之最佳萃取條件為萃取壓力350bar、萃取溫度80℃、萃取壓力60分鐘，得到真實樣品蕃茄紅素回收率為75.2%。

    ABSTRACT
    This work describes the extraction of lycopene from genetically engineered E. coli using supercritical carbon dioxide. To optimize supercritical fluid extraction (SFE) results for the isolation of lycopene, the factors assessed were the temperature of the extractor (40, 50, 60, 70, 80, 90and 100 °C), the pressure of the extraction fluid (250, 300,and 350 bar), addition of cosolvent (0, 0.5, 1.0 and 1.5 mL ethanol), extraction time (30, 60, 90 and 120 min). The results in this research have shown that the amount of the extractable lycopene depends on the experimental conditions. The total amounts of lycopene in the gene modified E. coli, extracts, and residues were determined by HPLC. A maximum of 75.2 % of lycopene was extracted by SC-CO2 in 60min at 80 °C and 350 bar, without the addition ethanol as a cosolvent.

    目 錄 頁次 第一章 緒論 1.1 前言……………………………………………………………………………………………………………………. 1 1.2 研究動機與目的………………………………………………………………………………………… 3 1.3 參考文獻………………………………………………………………………………………………………… 4 第二章 超臨界流體萃取基因重組後大腸桿菌中蕃茄紅素之研究 -單一因子實驗法 2.1 前言…………………………………………………………………………………………………………………… 5 2.2 蕃茄紅素簡介……………………………………………………………………………………………… 6 2.2.1 類胡蘿蔔素……………………………………………………………………………………. 6 2.2.2. 蕃茄紅素………………………………………………………………………………………… 6 2.3 基因重組………………………………………………………………………………………………………… 10 2.3.1 細菌簡介………………………………………………………………………………………… 10 2.3.2 細胞壁……………………………………………………………………………………………… 10 2.3.3 細胞膜……………………………………………………………………………………………… 11 2.3.4細胞質與核質體…………………………………………………………………………… 12 2.3.5 其他結構………………………………………………………………………………………… 13 2.4 基因重組技術……………………………………………………………………………………… 14 2.4.1 基因重組………………………………………………………………………… 14 2.4.2 基因重組技術………………………………………………………………………… 16 2.5 研究動機………………………………………………………………………………………………… 18 2.6 研究方法………………………………………………………………………………………………… 19 2.6.1 大腸桿菌…………………………………………………………………………………… 19 2.6.2 超臨界流體萃取…………………………………………………………………… 21 2.6.2.1食品中殘餘溶劑規範………………………………………………… 21 2.6.2.2超臨界流體……………………………………………………………………… 22 2.6.2.2.1 超臨界流體的選擇…………………………………………… 23 2.6.2.2.2 超臨界流體萃取過程……………………………………… 24 2.6.2.2.2.1 基質和目標物之關係…………………………… 25 2.6.2.2.2.2 流體和目標物的關係…………………………… 25 2.6.2.2.2.3 流體和基質的關係………………………………… 26 2.6.2.2.3 超臨界流體於天然物萃取之應用…………… 26 2.7 材料、儀器設備及實驗方法………………………………………………………… 29 2.7.1試藥………………………………………………………………………………………………… 29 2.7.2 樣品……………………………………………………………………………………………… 29 2.7.3 儀器設備…………………………………………………………………………………… 29 2.7.4 實驗方法…………………………………………………………………………………… 30 2.7.4.1 標準溶液的配製………………………………………………………… 30 2.7.4.2 樣品前處理…………………………………………………………………… 30 2.7.4.3 超臨界流體萃取………………………………………………………… 31 2.7.4.3.1 超臨界流體實驗參數最適化……………………… 31 2.7.4.3.2 儀器分析及實驗參數……………………………………… 32 2.7.4.3.3 蕃茄紅素之檢量線製備………………………………… 32 2.8 結果與討論…………………………………………………………………………………………… 33 2.8.1 分析方法…………………………………………………………………………………… 33 2.8.2 單一因子實驗法…………………………………………………………………… 33 2.8.2.1 萃取溫度………………………………………………………………………… 33 2.8.2.2 萃取壓力………………………………………………………………………… 34 2.8.2.3 動態萃取時間……………………………………………………………… 34 2.8.2.4 修飾劑量………………………………………………………………………… 35 2.9 結論…………………………………………………………………………………………………………… 37 2.10 參考文獻……………………………………………………………………………………………… 38 第三章 超臨界流體萃取基因重組後大腸桿菌中蕃茄紅素之研究 -田口式實驗法 3.1 實驗計畫法…………………………………………………………………………………………… 62 3.2 材料、儀器設備及實驗方法………………………………………………………… 64 3.2.1試藥………………………………………………………………………………………………… 64 3.2.2 樣品……………………………………………………………………………………………… 64 3.2.3 儀器設備…………………………………………………………………………………… 64 3.2.4 實驗方法…………………………………………………………………………………… 65 3.2.4.1 樣品前處理…………………………………………………………………… 65 3.2.4.2 超臨界流體萃取………………………………………………………… 65 3.2.4.2.1 超臨界流體實驗參數最適化……………………… 65 3.2.4.2.2 儀器分析及實驗參數……………………………………… 66 3.3 結果與討論…………………………………………………………………………………………… 67 3.3.1 田口式實驗計畫法……………………………………………………………… 67 3.3.2 最適化結果……………………………………………………………………………… 70 3.4 結論…………………………………………………………………………………………………………… 71 3.5 參考文獻………………………………………………………………………………………………… 72 第四章 超臨界流體萃取基因重組後之大腸桿菌中蕃茄紅素之研究 -真實樣品回收探討 4.1 前言…………………………………………………………………………………………………………… 76 4.2 材料、儀器設備及實驗方法………………………………………………………… 76 4.2.1試藥………………………………………………………………………………………………… 76 4.2.2 樣品……………………………………………………………………………………………… 77 4.2.3 儀器設備…………………………………………………………………………………… 77 4.2.4 實驗方法…………………………………………………………………………………… 78 4.2.4.1 樣品前處理…………………………………………………………………… 78 4.2.4.2 超臨界流體萃取………………………………………………………… 78 4.2.4.3 儀器分析及實驗參數……………………………………………… 79 4.3 結果與討論…………………………………………………………………………………………… 80 4.3.1 真實樣品回收率探討………………………………………………………… 80 4.3.2 蕃茄紅素的損失…………………………………………………………………… 80 4.3.3蕃茄紅素含量…………………………………………………………………………… 81 4.4 結論…………………………………………………………………………………………………………… 82 4.5 參考文獻………………………………………………………………………………………………… 84 表 目 錄 第二章 超臨界流體萃取基因重組後大腸桿菌中蕃茄紅素之研究 -單一因子實驗法 表1、 類胡蘿蔔素化學結構………………………………………………………………………………………………… 42 表2、 含氧類胡蘿蔔素化學結構……………………………………………………………………………………… 43 表3、 蕃茄紅素含量………………………………………………………………………………………………………………… 44 表4、 茄紅素對人體健康的主要功能…………………………………………………………………………… 44 表5、 歐盟建議食品中蕃茄紅素的用途及用量……………………………………………………… 45 表6、 歐洲允許GMP製程使用之萃取溶劑……………………………………………………………… 46 表7、 歐洲對於食品工業萃取溶劑之使用狀況及殘留量之規範………………… 46 表8、 歐洲對於食品工業萃取溶劑之使用狀況及殘留量之規範………………… 47 表9、 美國使用於食品之部分溶劑用途及其殘留標準……………………………………… 48 表10、 我國溶劑類食品添加物使用範圍及用量標準…………………………………………… 49 表11、 為二氧化碳的氣體、液體和超臨界流體物理性質之比較………………… 50 表12、 適合做為壓縮溶劑之氣體及其性質………………………………………………………………… 50 表13、 超臨界流體萃取之代表性天然物……………………………………………………………………… 51 表14、 超臨界流體萃取植物中有效成分與傳統方法之比較…………………………… 52 表15、 超臨界流體萃取基因重組後之大腸桿菌中蕃茄紅素之各因子變 數水準表-單一因子實驗法…………………………………………………………………………………… 53 第三章 超臨界流體萃取基因重組後大腸桿菌中蕃茄紅素之研究 -田口式實驗法 表1、 超臨界流體萃取基因重組後之大腸桿菌中蕃茄紅素之各因子變 數水準表-田口式實驗法………………………………………………………………………………………… 73 表2、 田口式實驗計畫法於超臨界流體萃取蕃茄紅素之實驗條件配置… 73 表3、 超臨界流體萃取蕃茄紅素各因子於各水準之水準效果值………………… 73 第四章 超臨界流體萃取基因重組後大腸桿菌中蕃茄紅素之研究 -真實樣品回收探討 表1、 超臨界流體萃取基因重組後之大腸桿菌中蕃茄紅素之回收率……… 85 表2、 蕃茄紅素在超臨界流體萃取各步驟回收率………………………………………………… 85 表3、 超臨界流體萃取基因重組後之大腸桿菌中蕃茄紅素與文獻中超 臨界流體萃取蕃茄紅素之回收率比較…………………………………………………………… 85 圖 目 錄 第二章 超臨界流體萃取基因重組後大腸桿菌中蕃茄紅素之研究 -單一因子實驗法 圖1、 茄紅素在微生物體內由不同之環化酶所催化之環化反應之修飾 下，形成β-carotene、γ-carotene、與astaxanthin…………………………………… 54 圖2、 大腸桿菌利用基因重組技術生產類胡蘿蔔素之生物途徑………………… 55 圖3、 大腸桿菌利用基因重組技術生產類胡蘿蔔素之各種質粒結構……… 56 圖4、 二氧化碳之三相圖……………………………………………………………………………………………………… 57 圖5、 蕃茄紅素之液液萃取及超臨界流體萃取之實驗流程圖……………………… 58 圖6、 蕃茄紅素標準品的HPLC圖譜…………………………………………………………………………… 59 圖7、 蕃茄紅素的HPLC檢量線……………………………………………………………………………………… 59 圖8、 超臨界流體萃取溫度對蕃茄紅素回收率之影響……………………………………… 60 圖9、 超臨界流體萃取壓力對蕃茄紅素回收率之影響……………………………………… 60 圖10、 動態萃取時間對蕃茄紅素回收率之影響……………………………………………………… 61 圖11、 修飾劑添加量對蕃茄紅素回收率之影響……………………………………………………… 61 第三章 超臨界流體萃取基因重組後大腸桿菌中蕃茄紅素之研究 -田口式實驗法 圖1、 蕃茄紅素之液液萃取及超臨界流體萃取之實驗流程圖……………………… 74 圖2、 超臨界流體萃取蕃茄紅素各因子於各水準之水準效果值………………… 75 第四章 超臨界流體萃取基因重組後大腸桿菌中蕃茄紅素之研究 -真實樣品回收探討 圖1、 蕃茄紅素之液液萃取及超臨界流體萃取之實驗流程圖……………………… 86 圖2、 超臨界流體萃取蕃茄紅素各步驟損失探討之萃取流程……………………… 87

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