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研究生： 劉珊妏
Shan-Wen Liu
論文名稱： 利用纖維母細胞生長因子-1啟動子驅動多影像報導基因之基因轉殖鼠模型
Development of Fibroblast Growth Factor 1-Trimodal Imaging Reporter transgenic Mouse
指導教授： 許靖涵
Ching-Han Hsu
林名釗
Kurt M. Lin
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 原子科學院 - 生醫工程與環境科學系
Department of Biomedical Engineering and Environmental Sciences
論文出版年： 2008
畢業學年度： 96
語文別： 中文
論文頁數： 64
中文關鍵詞： 纖維母細胞生長因子 、基因轉殖 、影像報導基因
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    • 多重影像系統之應用結合了原本屬於各種影像系統之特色及優點，大幅改善影像結果的解析度及功能性，增加臨床上之應用價值。具有多重影像報導基因之動物模型，更能同時運用多種成像系統進行觀測並互相驗證。在本篇論文裡，我們成功結合了三種不同影像報導基因，包括利用螢火蟲冷光酵素、綠螢光蛋白、以及第一型單純疱疹病毒胸腺嘧啶激酶，並且利用專一於腦部表達之纖維母細胞生長因子-1.B 啟動子來驅動轉殖基因。利用各成像系統相對應之探針，可以檢視所生產出基因轉殖動物之基因表達模式。我們建立出帶有此FGF-1.B-TMIR 載體之基因轉殖小鼠模型後，希望可以利用其影像上之優勢，應用於追蹤腦部細胞之增生、分化、遷移、以及發展之機制及過程。
    我們檢視了由540 鹼基對長度之纖維母細胞生長因子-1.B 啟動子驅動之基因轉殖鼠，可以成功地表達後續之三種影像報導基因。也於體外細胞實驗中，利用暫態轉染TMIR 載體之方法來確認各報導基因之功能無誤。目前成功保持六個獨立F1B-TMIR 之基因轉殖鼠品系，各攜帶不同套數之轉殖基因。由成鼠活體冷光影像實驗之結果說明，此轉殖基因如預期地集中於腦部。但我們也發現在不同品系之間其基因表現模式稍有差異。造成差異之原因可能來自於不同品系之間所攜帶不同之轉殖基因套數，以及轉殖基因嵌插入染色體位置不同所致。在某些品系中，轉殖基因的表現主要在前腦腹側以及嗅覺系統，而其餘之品系主要分佈於腦幹以及頭骨軟骨組織。而實驗結果顯示，轉殖基因的表現在胚胎發育過程較為廣泛，如胚胎及幼鼠之軟骨系統，包括耳廓及耳道等處、軟骨膜、黏膜組織以及嗅覺系統等，而在成鼠之表現分布則較為集中。我們需要對胚胎及成鼠組織以組織免疫染色進行觀察及比較，才能確認幼鼠與成鼠表現模式之差異。具有多項成像系統報導基因之小鼠將有助於對纖維母細胞生長因子-1 在胚胎發育及各種疾病過程中扮演角色之探討。

    目錄 目錄………………………………………………………………………i 圖目錄……………………………………………………………………iv 表目錄……………………………………………………………………vi 第1章 序論………………………………………………………………1 第1-1節 實驗動物之發展與價值………………………………………1 第1-2節 分子影像系統…………………………………………………4 第1-3節 影像報導基因…………………………………………………5 第1-4節 纖維母細胞生長因子-1………………………………………6 第2章 分子影像系統成像原理…………………………………………12 第2-1節 生物冷光成像原理……………………………………………12 第2-2節 螢光成像原理…………………………………………………14 第2-3節 第一型單純疱疹病毒胸腺嘧啶激酶成像原理………………15 第3章 實驗目標…………………………………………………………18 第4章 實驗材料與方法…………………………………………………20 第4-1節 轉殖基因質體的構築…………………………………………20 第4-1-1節 F1B-eGFP-ΔTK ……………………………………………20 第4-1-2節 F1B-Luc-eGFP-ΔTK & CMV-Luc-eGFP-ΔTK………………24 第4-2節 In vitro驗證基因表現………………………………………27 第4-2-1節 細胞轉染及光學系統觀察…………………………………27 第4-2-2節 腫瘤壞死因子-α之誘導測試 ……………………………29 第4-2-3節 Ganciclovir (GCV)之毒性測試…………………………29 第4-3節 基因轉殖鼠之產生……………………………………………29 第4-4節 基因轉殖鼠之篩選……………………………………………30 第4-4-1節 基因轉殖小鼠Genomic DNA之萃取………………………30 第4-4-2節 以聚合酶連鎖反應進行轉殖基因確認……………………31 第4-4-3節 以南方點墨法分析並確認轉殖基因………………………32 第4-5節 In vivo轉殖基因表現之觀察………………………………34 第4-5-1節 光學造影系統觀察…………………………………………34 第4-6節 免疫化學染色…………………………………………………34 第4-6-1節 石蠟包埋與組織切片………………………………………34 第4-6-2節 組織免疫螢光染色…………………………………………35 第5章 實驗結果與討論…………………………………………………37 第5-1節 In vitro細胞轉染驗證基因表現……………………………37 第5-2節 以南方點墨法進行基因轉殖鼠之基因型分析………………44 第5-3節 In vivo觀察報導基因表現…………………………………48 第5-4節 組織免疫螢光染色……………………………………………53 第6章 結論與未來方向…………………………………………………62 圖目錄 圖1-1.纖維母細胞生長因子家族之演化關係…………………………8 圖1-2. FGF1.B啟動子驅動SV40 large T抗原基因轉殖鼠所發展之腦瘤模型分布圖……………………………………………………………11 圖2-1.第一型單純疱疹病毒胸腺嘧啶激酶之成像原理及應用於基因治療方式之示意圖…………………………………………………………17 圖4-1. F1B-GFP質體圖…………………………………………………21 圖4-2. CMV-eGFP-ΔTK質體圖…………………………………………22 圖4-3. F1B-eGFP-ΔTK質體圖…………………………………………23 圖4-4. F1B-Luc-eGFP-ΔTK (F1B-TMIR)質體圖 ……………………26 圖4-5. CMV-Luc-eGFP-ΔTK (CMV-TMIR)質體圖 ……………………27 圖5-1. F1B-TMIR質體暫態轉染入細胞後之螢光表現………………37 圖5-2.腫瘤壞死因子-α之誘導測試於F1B-TMIR質體暫態轉染入細胞後之螢光表現……………………………………………………………39 圖5-3. Ganciclovir之毒性測試於F1B-TMIR質體暫態轉染入細胞後之螢光表現…………………………………………………………………42 圖5-4.利用南方點墨法進行F1B-TMIR基因轉殖小鼠#4、#49及#7品系之基因型分析……………………………………………………………45 圖5-5.利用南方點墨法進行F1B-TMIR基因轉殖小鼠#2、#29及#50品系之基因型分析……………………………………………………………45 圖5-6.利用南方點墨法區別F1B-TMIR基因轉殖小鼠子代基因型同、異型合子之異………………………………………………………………47 圖5-7. #29品系小鼠之活體冷光成像…………………………………49 圖5-8. #2品系小鼠之活體冷光成像 …………………………………50 圖5-9. #7品系小鼠之活體冷光成 ……………………………………51 圖5-10. #49品系小鼠之活體冷光成像 ………………………………52 圖5-11.胚胎發育中之觸毛濾泡免疫螢光染色 ………………………55 圖5-12.胚胎發育中之彈性軟骨組織免疫螢光染色 …………………56 圖5-13.發育中之透明軟骨免疫螢光染色 ……………………………57 圖5-14.胚胎發育中之軟骨膜組織免疫螢光染色 ……………………58 圖5-15.發育中舌、以及口腔黏膜細胞免疫螢光染色 ………………59 圖5-16.發育中之嗅球組織免疫螢光染色 ……………………………60 圖5-17.胚胎發育中之心臟免疫螢光染色 ……………………………61 表目錄 表5-1.腫瘤壞死因子-α之誘導測試於F1B-TMIR質體暫態轉染入細胞後之冷光表現……………………………………………………………40 表5-2.腫瘤壞死因子-α之誘導測試於對照組CMV-TMIR質體暫態轉染入細胞後之冷光表現……………………………………………………40 表5-3. Ganciclovir之毒性測試於F1B-TMIR質體暫態轉染入細胞後之冷光表現…………………………………………………………………43 表5-4. Ganciclovir之毒性測試於對照組CMV-TMIR質體暫態轉染入細胞後之冷光表現…………………………………………………………43

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