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研究生： 張原銘
Chang, Yuan-Ming
論文名稱： 利用核磁共振探討人類鈣離子結合S100A11蛋白質水溶液結構以及其與RAGE V-domain之間的交互作用
NMR Structure of Calcium Bound Human S100A11 and Its Interaction with RAGE V-Domain
指導教授： 余靖
口試委員: 莊偉哲
洪嘉呈
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 理學院 - 化學系
Department of Chemistry
論文出版年： 2012
畢業學年度： 100
語文別： 中文
論文頁數： 84
中文關鍵詞： S100A11蛋白質 、RAGE蛋白質 、核磁共振
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    • 人類S100A11為一雙聚體蛋白質，其具有可以與鈣離子結合的EF-hand，而與鈣離子結合後會改變其構形並與目標蛋白交互作用，而RAGE為其中一種會與S100A11結合的目標蛋白。RAGE隸屬於表面細胞分子中的免疫球蛋白，與不同的配體結合後，可以誘導不同的細胞訊息傳遞，因此在許多疾病當中扮演非常重要的角色。
    在第二章中，我們利用疏水性管柱以及鈷離子親和性管柱分別純化人類S100A11蛋白質與RAGE V蛋白質，而在第三、四章中，由於人類S100A11與鈣離子結合的結構目前尚未清楚，因此我們希望藉由NMR解出其水溶液結構，並進一步探討其與配體之間的交互作用。我們使用多維度核磁共振實驗如HNCA、HN(CO)CA、HCCH-TOCSY以及HCCH-COSY等來完成所有的化學位移判定，並利用實驗所得的距離、雙面角、氫鍵限制條件以及ARIA/CNS軟體解出人類鈣離子結合S100A11水溶液結構。
    在第五章中，為了瞭解S100A11與RAGE分子層級的結合區域，我們利用二維1H-15N HSQC滴定實驗來找出S100A11與RAGE可能的結合位置，並且利用螢光實驗以及分析級超高速離心機探討他們之間的交互作用，從這些數據中，我們發現S100A11與RAGE確實有形成複合物的可能性存在。 

    Human S100A11 is a homodimeric EF-hand calcium binding protein that undergoes a calcium-induced conformational change and interacts with target protein. RAGE is a multiligand receptor binding to S100A11 and the interactions at molecular level have not been reported. It is a member of the immunoglobulin protein family of cell surface molecules. RAGE plays an important role in many human pathologies by inducing cellular signaling actions upon binding of different ligands.
    In chapter 2, we purified human S100A11 and RAGE V by using phenyl-sepharose column and cobalt affinity column. In chapter 3 and 4, chemical shift assignments were made from HNCA, HN(CO)CA, HCCH-TOCST and HCCH-COSY,etc. Furthermore, the solution structure of human calcium bound S100A11 was determined by ARIA/CNS software using the experimental restraints such as distance, dihedral angle, hydrogen bond.
    In chapter 5, we used a variety of biophysical methods, including 2D 1H-15N HSQC titration, fluorescence spectroscopy and analytical ultracentrifugation, to characterize the binding interface regions and interactions between S100A11 and RAGE at the molecular level. Finally, we postulate that S100A11 and RAGE might interact with each other.

    摘要 i 謝誌 iv 目錄 v 圖目錄 vii 表目錄 x 縮寫表 xi 第一章 前言 1 1.1 S100蛋白質家族之結構與其特性 1 1.2 S100A11蛋白質之結構與其特性 2 1.3 RAGE 之結構與其特性 5 1.4 S100蛋白質與RAGE在訊息傳遞上所扮演的功能 8 1.5 蛋白質的表現與純化 10 1.6 生物核磁共振技術介紹 12 1.7 ARIA/CNS結構計算 18 1.8 實驗動機 21 第二章 材料與方法 23 2.1 人類S100A11與RAGE V蛋白質基因的取得 23 2.2 人類S100A11與RAGE V蛋白質基因的表現 23 2.3 人類Apo-S100A11蛋白質純化 25 2.4 人類Ca2+-S100A11蛋白質的純化 26 2.5 RAGE V蛋白質的純化 27 2.6 人類S100A11與RAGE V基本性質的鑑定 29 2.7 人類S100A11蛋白質分子的三維核磁共振實驗 31 2.8 人類S100A11蛋白質的結構計算 33 第三章 結果與討論 38 3.1 人類S100A11與RAGE V 的取得、表現、純化及基本性質的鑑定 38 3.1.1 人類S100A11蛋白質在大腸桿菌的表現 38 3.1.2 大量表現人類S100A11蛋白質 39 3.1.3 人類S100A11蛋白質的純化與分離 40 3.1.4 人類Ca2+-S100A11蛋白質的製備 41 3.1.5 RAGE V蛋白質的表現與純化 42 3.1.6 人類S100A11與RAGE V蛋白質的分子量鑑定 44 3.1.7 人類S100A11與RAGE V蛋白質的HSQC 46 3.2 人類S100A11蛋白質分子的三維核磁共振實驗 47 3.2.1 人類S100A11蛋白質分子的骨架循序判定 47 3.2.2 人類S100A11蛋白質分子的支鏈循序判定 51 3.2.3 人類S100A11化學位移完成度與data deposition 54 3.3 人類S100A11蛋白質分子的結構計算 55 3.3.1 雙面角限制條件 55 3.3.2 CSI(Chemical shift index) 56 3.3.3 Isotope Filter NMR 58 3.3.4 人類S100A11蛋白質的結構計算 60 3.3.5 人類S100A11與已發表結構的比較 64 3.4 人類S100A11與RAGE V domain之間的交互作用探討 66 3.4.1 HSQC滴定實驗 66 3.4.2 螢光實驗 70 3.4.3 分析級超高速離心機實驗(AUC ) 72 3.4.4 HADDOCK(High Ambiguity Driven Docking) 74 結論 77 參考文獻 78 附錄 82

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