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研究生： 張勝傑
論文名稱： 利用核磁共振技術探討鋅離子結合mS100A4蛋白 質結構與鋅離子調節mS100A4蛋白質與其配體之交互作用
NMR Structure of Zn2+-mS100A4 Protein and Zn2+ Regulates interaction between mS100A4 and its Ligand
指導教授： 余靖
口試委員: 洪嘉呈
蘇士哲
余靖
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 理學院 - 化學系
Department of Chemistry
論文出版年： 2014
畢業學年度： 102
語文別： 中文
論文頁數： 70
中文關鍵詞： 蛋白質結構 、核磁共振 、鋅離子 、mS100A4蛋白質
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    • 在生物系統中的許多蛋白質有其獨特的作用區域，可與特定的分子結合，決定蛋白質的活性與功能。這些作用的分子包含蛋白、胜肽、金屬離子及藥物等等。本篇論文進行的研究案例，即是蛋白質與金屬離子之交互作用。
    　　人類S100A4蛋白質隸屬於S100蛋白質家族，水溶液狀態下為一同質雙聚體蛋白質，於人體中具有多樣的生理活性。其具有EF-hand之結構，能與鈣離子結合而改變構型並與多種蛋白質作用。除此之外，研究也指出，鋅離子也可與S100蛋白質家族結合並調節S100蛋白質與其配體之交互作用。因此在本篇論文中，我們希望進一步了解基因突變mS100A4蛋白質與鋅離子之間的交互作用，並解析其形成複合物之後的結構特性。
    　　我們利用二維15N-1H HSQC 滴定實驗找出mS100A4蛋白質與鋅離子可能的結合位置，進一步搭配三維核磁共振實驗HNCA、HN(CO)CA、HCCH-TOCOSY以及HCCH-COSY等來完成蛋白質的化學位移判定，並利用實驗所得的距離、雙面角、氫鍵限制條件經由軟體計算，解出鋅離子結合mS100A4水溶液結構。最後我們利用螢光滴定的方式，去測量mS100A4蛋白質與其配體EGF蛋白質之間的解離常數，來觀察加入鋅離子是否影響到兩者之間的親和力。此研究幫助我們更了解S100蛋白質家族與鋅離子之間的反應情形。然而後續仍需更進一步的研究，以探討此反應是否與實際生理情形相關。

    摘要 ii 目錄 iv 圖目錄 vii 表目錄 x 縮寫表 xi 第一章 前言 1 1.1 生物核磁共振技術介紹 1 1.1.1 核磁共振光譜之樣品製備 2 1.1.2 蛋白質分子的骨架循序判定 3 1.1.3 蛋白質分子的支鏈循序判定 5 1.2 計算蛋白質結構之限制條件 6 1.2.1距離限制條件(NOE Distance Constraints) 6 1.2.2雙面角限制條件 7 1.2.3氫鍵限制條件(Hydrogen Bond Constraints) 8 1.3 ARIA/CNS結構計算 8 1.4 S100蛋白質家族之結構與其特性 10 1.5 S100A4蛋白質之結構與特性 11 1.6 S100蛋白與鋅離子之交互作用 12 1.7 實驗動機 13 第二章 材料與方法 15 2.1 mS100A4蛋白質之基因取得及表現 15 2.1.1 mS100A4蛋白質的表現 15 2.1.2 mS100A4蛋白質的純化 17 2.1.3 mS100A4蛋白質之濃度測定 20 2.2 EGF蛋白質之基因取得及表現 21 2.2.1 EGF蛋白質的表現 21 2.2.2 EGF之純化 22 2.2.3 EGF之濃度測定 24 2.3 蛋白質基本性質鑑定 24 2.3.1蛋白質質量鑑定 24 2.3.2二維核磁共振實驗 25 2.4 mS100A4蛋白質與鋅離子之交互作用 26 2.4.1核磁共振滴定實驗(HSQC titration) 26 2.4.2三維核磁共振實驗 27 2.5 Zn2+-mS100A4蛋白質分子的結構計算 28 2.6 螢光滴定實驗 29 第三章 結果與討論 31 3.1 mS100A4蛋白質在大腸桿菌的表現 31 3.1.1異丙基硫化半乳糖(IPTG)對大腸桿菌之誘導作用 31 3.1.2大量表現mS100A4蛋白質 32 3.1.3 mS100A4蛋白質之純化 33 3.2. EGF的表現與純化 35 3.3 蛋白質基本性質之測定 38 3.3.1 S100A4與EGF的分子量鑑定 38 3.3.2 mS100A4蛋白質二維1H-15N HSQC光譜 40 3.4 mS100A4與鋅離子之交互作用 41 3.4.1核磁共振滴定實驗(HSQC Titration) 41 3.4.2 mS100A4蛋白質與鋅離子之解離常數 44 3.4.3三維核磁共振實驗 45 3.4.3.1 Zn2+-mS100A4蛋白質分子的骨架循序判定 45 3.4.3.2 Zn2+-mS100A4蛋白質分子的支鏈循序判定 47 3.4.4 Zn2+-mS100A4之化學位移完成度 48 3.5 Zn2+-mS100A4蛋白質分子的結構計算 49 3.5.1 雙面角限制條件與氫鍵限制條件 49 3.5.2距離限制條件 51 3.5.3 ARIA/CNS軟體計算mS100A4蛋白質結構 52 3.6 Zn2+-mS100A4蛋白質結構 56 3.6.1 Zn2+-mS100A4與鋅離子之配位基團 56 3.6.2 Zn2+-mS100A4結構與mS100A4結構之比較 57 3.7 鋅離子對mS100A4與其配體之影響 59 3.7.1 螢光滴定實驗 59 結論與未來展望 62 參考文獻 63 附錄 67

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