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研究生： 許湞陽
Chen-Yang Hsu
論文名稱： 大腸桿菌PriB蛋白分子與單股DNA複合體的結晶學結構研究
Crystallographic study of Escherichia coli PriB complex with single-stranded DNA
指導教授： 孫玉珠
Yuh-Ju Sun
蕭傳鐙
Chwan-Deng Hsiao
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 生命科學暨醫學院 - 生物資訊與結構生物研究所
Institute of Bioinformatics and Structural Biology
論文出版年： 2004
畢業學年度： 92
語文別： 中文
論文頁數： 47
中文關鍵詞： PriB 、引子合成體 、許湞陽 、ΦX174型態
外文關鍵詞： PriB, Primosome, Chen-Yang Hsu, ΦX174type
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    • 在大腸桿菌 (Escherichia coli)中的DNA複製需要引子合成體 (Primosome)、RNA引子 (RNA primer)、單股DNA結合蛋白質 (Single-stranded DNA-binding protein，後稱SSB)以及DNA聚合酶 (DNA polymerase)I，III參與。引子合成體作用在延遲股 (Lagging strand)，它負責確認DNA複製的起始點並解開雙股螺旋，以及合成RNA引子 (Primer)。大腸桿菌裡至少有兩種引子合成體已經被確認了，分別是OriC型態和ΦX174型態 (又稱PriA-dependent primosome)。當大腸桿菌的複製叉受損時，需要進行修復才能在重新啟動DNA的複製，這時PriA引子合成體的複製系統扮演非常重要的角色。引子合成體是由七個蛋白質組成的: PriA、PriB、PriC、DnaB、DnaC、DnaT and DnaG (Primase)。而PriB在引子合成體中所扮演的角色為 (1)穩定PriA與DNA-PAS (Primosome assembly site)的結合和 (2) 促進PriA-DnaT之間複合體的合成。在本研究中我們嘗試利用單股DNA與PriB結合進行結晶，並利用X光繞射方法解出PriB與DNA複合體的三級結構。
    PriB與dA5mer複合體在25 ℃下，母液為500 mM NaCl，100 mM Na3PO4 pH 7.0，20% PEG 4000，PriB-dA5mer複合體與母液以體積比為2 : 1混和，形成片狀晶體。此晶體經由X光繞射得到繞射點的解析度可達2.8 Å，PriB-DNA複合體晶體的空間群屬於Monoclinic的P21，它的晶胞參數是a=47.4 Å，b=45.67 Å，c= 51.48 Å，β=96.1°。1個最小不對稱單元 (asymmetric unit)可以容納2個分子。由PriB-dA5mer複合體的三級結構得知dA5mer結合位置在PriB的Loop12與Loop45形成的溝槽 (groove)區域內。而DNA上帶負電荷的磷酸根會被帶正電荷的Lys89 (Loop45)吸引，並且會與Ser20 (Loop12)產生氫鍵作用。

    Analyses of primosome assembly at chromosomal and plasmid origins as well as that at single-stranded replication origins revealed the presence of two distinct primosomes in Escherichia coli for primer RNA synthesis and duplex unwinding. A DnaA-dependent primosome is assembled at oriC, the chromosomal origin of Escherichia coli, as well as at the A site. In contrast, PriA protein recognizes a hairpin, called PAS (primosome assembly site), and initiates assembly of the ΦX174-type PriA-dependent primosome in conjunction with other prepriming proteins.
    Seven primosomal protein, PriA, PriB, PriC, DnaB, DnaC, DnaG and DnaT, are required for the assembly of a primosome at the primosome assembly site (PAS) on a single-stranded DNA-binding protein (SSB)-coatedΦX174 phage DNA. PriB stabilizes PriA on the DNA, this cannot be the sole reason it facilitates binding of DnaT, and it is likely that PriB-induced conformational rearrangements contribute as well. The data presented thus far suggest that PriB acts to facilitate entry of DnaT into a complex with PriA.
    We solved the crystal structure of the PriB and dA5mer complex from Escherichia coli at a resolution of 2.8 Å. The crystal of PriB-dA5mer belong to the Monoclinic space group P21 and cell parameter is a=47.4 Å，b=45.67 Å，c= 51.48 Å，β=96.1°。There are two PriB molecules per one asymmetric unit. We solved the phase problem by using MR method from PriB model. The structure of PriB is similar to that of single-stranded DNA binging protein (SSB), even though they share only 16% amino acid sequence identity. We describe here the structure of the PriB complex with dA5mer.

    目 錄 中文摘要 I 英文摘要 II 誌謝 IV 目錄 V 表目錄 VIII 圖目錄 IX 第一章 序論 1~7 1-1 Primosomes的簡介 1-2 PriB的功能 1-3 PriB的結構 1-4 X-ray決定蛋白質的結構 1-5 研究動機與內容簡介 第二章 材料與方法 8~18 2-1 PriB的DNA製備與表現 2-1.1 宿主菌體 (Host Bacterial) 2-1.2 質體的轉型作用 2-2 PriB蛋白質在大腸桿菌的表現與纯化 2-2.1 蛋白質的培養與誘導 (induction) 2-2.2 蛋白質的製備 2-2.3 以固定化金屬親和層析法纯化PriB (IMAC，immobilized metal-affinity chromatography) 2-2.4 以膠體層析法純化PriB蛋白質 (Gel filtration) 2-3 PriB蛋白質的結晶過程 2-3.1 長晶方法 (Crystallization) 2-3.2 蛋白質PriB與單股DNA的混和步驟 2-3.3 結晶條件的篩選 2-3.4同晶置換法 (Multiple Isomorphous Replacement MIR) 2-4 利用X-ray決定PriB與dA5mer的三級結構的結構 2-4.1 繞射數據之收集與處理 2-4.2 Matthews coefficient (Vm)的估計 2-4.3溶劑比例 (Solvent content)的估計 2-4.4晶體之相位決定 2-4.5 分子模型的建立與修飾 (model building and refinement) 第三章 實驗結果 19~23 3-1 蛋白質PriB的純化 3-2 PriB-DNA複合體晶體 3-3 PriB-DNA複合體的三級結構 第四章 討論 24~27 4-1 PriB-dA5mer複合體的繞射數據 4-2 PriB-dA5mer複合體三級結構中dA5mer的位置 4-3 PriB alone與PriB-dA5mer複合體在三級結構上的差別 4-4 PriB-dA5mer與SSB-dC35mer結構上的比對 4-5 PriB-dA5mer複合體結構上的待改進的地方 第五章 結論 28 參考文獻 29~30 表 31~34 圖 35~47 表目錄 表一. 大腸桿菌兩種引子合成體的蛋白質成分比較 31 表二. 單股DNA的序列 31 表三. PriB蛋白質與DNA混和後的濃度 32 表四. Crystalliztion Screen Kit 32 表五.可以適用PriB-dA5mer複合體的重金屬種類與濃度 32 表六. PriB alone與PriB-dA5mer比較 33 表七. PriB-dA5mer與SSB-dC35mer在結構上的差異 34 圖目錄 圖1. Primosome Assemble Site (PAS)的二級結構 35 圖2. Primosome在ΦX174的DNA複製過程 35 圖3. PriB (Protein n)的萃取 36 圖4. OB-fold的三級結構 36 圖5. PriB的蛋白質表現 37 圖6. PriB的親和層析法纯化 37 圖7. PriB蛋白質的濃度 (20% SDS PAGE) 37 圖8. PriB的Gel filtration純化 38 圖9. PriB蛋白質的質譜儀分析圖 39 圖10. PriB經過Gel filtration純化後的電泳圖 39 圖11. PriB與不同片段的DNA混和後的電泳圖 39 圖12. PriB與dA5mer複合體的晶體 40 圖13. PriB與dA10mer複合體的晶體 40 圖14. PriB與dA15mer複合體的晶體 40 圖15. PriB與PAS30複合體的晶體 (偏光) 41 圖16. PriB-dA5mer的三級結構 42 圖17. PriB-dA5mer與不含DNA的PriB做三級結構的比對 (立體圖) 43 圖18. PriB-dA5mer的三級結構中，與DNA距離最近的氨基酸 44 圖19. PriB-dA5mer複合體的potential surface圖 44 圖20. SSB-dC35mer與不含DNA的SSB做三級結構上的比較 (立體圖) 45 圖21. PriB-dA5mer與SSB-dC35mer做三級結構的比較 (立體圖) 45 圖22. PriB與不同種類的PriB和SSB蛋白質做氨基酸序列上的比對 46 圖23. 比較PriB-dA5mer (水藍色)與SSB-dC35mer (紅色)的DNA結合位置 47 圖24. PriB-dA5mer的Ramachandran Plot 47

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