Pseudomonas fluorescens生產脂肪水解酵素固定於聚甲基丙烯醯胺以生產S-AMPA的應用

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研究生：	姚少凌 Chao-Ling Yao
論文名稱：	Pseudomonas fluorescens生產脂肪水解酵素固定於聚甲基丙烯醯胺以生產S-AMPA的應用
指導教授：	朱一民 I-Ming Chu
口試委員:
學位類別：	碩士 Master
系所名稱：	工學院 - 化學工程學系 Department of Chemical Engineering
論文出版年：	2000
畢業學年度：	88
語文別：	中文
論文頁數：	77
中文關鍵詞：	水解酵素、聚甲基丙烯醯胺
外文關鍵詞：	lipase, PMAA, Pseudomonas fluorescens, MAMP, AMPA
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由於酵素具有高專一性、高反應性、高立體選擇性等優點，近年來利用酵素進行非對掌異構物之光學分割研究因而廣為受到重視，而酵素固定化技術的進步也使酵素的應用更具高穩定性和可重複使用性。所以本研究藉由專利菌株Pseudomonas fluorescens IFO 12055 所獲得的細胞內脂肪酵素lipase，固定化於自行製備之聚甲基丙烯醯胺共聚物擔體上，進行反應物 MAMP（Methyl-3-Acetylthio -2-Methylpropionate）酯鍵位置的水解反應，希望藉由不同反應條件的探討，能製備出高光學純度的產物 S-AMPA（Acetylthio-2 -Methylpropionic acid）（抗高血壓藥物 Captopril之前驅物）。
實驗結果發現將lipase共價鍵結固定化於具孔洞性的聚甲基丙烯醯胺共聚物擔體上時，於50℃、pH＝7.6具有極佳的長時間熱穩定度（20天後仍具有原活性的80%以上），且進行20個批次反應的操作，亦能維持80%的活性與高光學純度的表現。然而實驗發現，高濃度的MAMP不能完全分散溶解於水溶液中，導致固定化酵素活性的抑制，因此使用不同溶劑或添加界面活性劑作為改善的方法。此外實驗上亦發現，反應基質MAMP會有自然水解的現象；產物AMPA在水中會做進一步的醇解反應，並且酵素會受到酸性產物生成所造成的pH值下降而有失活的現象，這些都會影響到產物S-AMPA的光學純度與產率。所以本實驗目的在於尋找提高MAMP濃度的方法，以及求出各反應機構的速率常數，希冀藉此得到S-AMPA的大量化生產。

第一章 研究動機與目的………………………………………………1
第二章 文獻回顧………………………………………………………5

  2-1 Pseudomonas fluorescens 簡介……………….………………..5

  2-2 酵素與固定化技術的應用發展……………………..………….5

    2-2-1 酵素-生物觸媒……………………………………………..5

    2-2-2 酵素固定化的技術與優點………………………………...6

    2-2-3 固定化方法………………………………………………...7

    2-2-4 自製高分子擔體-懸浮聚合法……………………………..9

  2-3 抗高血壓藥物Captopril的發展……………………………..10

    2-3-1 Captopril的醫療原理與製造發展過程………………….10

    2-3-2 脂肪酵素的介紹…………………………………………..13

  2-4 酵素進行不對稱轉換型態和變數影響之探討……………….15

第三章 實驗步驟與方法……………………………………………...17

  3-1 菌體培養與酵素的取得………………………………………..17

  3-2 固定化酵素製備………………………………………………..18

    3-2-1擔體製備……………………………………………………18

    3-2-2 擔體之改質………………………………………………...20

    3-2-3 擔體之活化………………………………………………...21

    3-2-4 酵素固定化………………………………………………...21

  3-3 MAMP之製備及其純化步驟…………………………………..22

  3-4 定量方法..……………………………………………………….23

    3-4-1 發酵液中菌體量的測定…………………………………...23

    3-4-2 酵素含量測定……………………………………………...23

    3-4-3 反應物及產物之分析……………………………………...23

    3-4-4 反應產物AMPA光學純度之分析………………………..24

3-4-5 計算固定化效率…………………………………………...25

  3-5 酵素活性分析…………………………………………………...25

    3-5-1酵素活性分析……………………………………………….25

    3-5-2 不同pH值下的活性表現………………………………….25

    3-5-3 不同溫度下的活性表現…………………………………...26

    3-5-4 不同shaker轉速下的活性表現…………………………...26    3-5-5 界面活性劑與有機溶劑的添加對活性的影響…………...26    3-5-6 動力學常數測定…………………………………………...26

  3-6 批次反應………………………………………………………...27

    3-6-1低反應基質濃度（25mM MAMP）…………………………27

3-6-2高反應基質濃度（125mM MAMP）………………………27

第四章 實驗材料與設備………………………………………………28

  4-1 分析儀器…………………………………………………….…..28

  4-2 養菌設備………………………………………………….……..28

  4-3 其他使用之設備…………………………………………….…..29

  4-4 藥品與材料……..………….……………………………………30

第五章 實驗結果與討論………………………………………………32

  5-1 菌體的培養……………………………………………………...32

  5-2 固定化擔體的合成與酵素的保存……………………………...32

    5-2-1 固定化擔體的性質………………………………………...32

    5-2-2 固定量和活性測試………………………………………...33

    5-2-3 酵素的保存………………………………………………...33

  5-3 MAMP之合成…………………………………………………..35

  5-4 反應pH值與溫度對活性之影響………………………………36

    5-4-1 不同反應pH值對酵素活性的影響………………………36

    5-4-2 不同反應溫度對酵素活性的影響………………………...36

    5-4-3 不同shaker轉速對反應速率的影響……………………...37

  5-5 動力學常數測定………………………………………….……..38

  5-6 MAMP與AMPA的自然水解…………...……………………..39

  5-7 MAMP與AMPA各種水解速率常數的測定……..……………40

5-7-1 反應溫度為25℃的速率常數……………………………...40

5-7-2 反應溫度為50℃的速率常數……………………………...41

5-7-3 Simulation……………………...…………………………...41

  5-8 不同MAMP起始濃度對AMPA產率的影響…………………42

5-9 有機溶劑與界面活性劑的添加對AMPA產率的影響………..42

    5-9-1 toluene與n-hexane的選用………………………………...42

    5-9-2 界面活性劑的選用………………………………….……..43

5-10 長期批次反應………………………………………………….44

5-10-1 25mM的MAMP批次反應……………………….………44

5-10-2 125mM的MAMP批次反應…………………...…………44

  5-11 Scale-up…………………………………………...……………45

第六章 結論……………………………………………………………67

第七章 參考文獻………………………………………………………68

圖目錄

圖1-1 Zofenopril 和 Captopri 之結構…………………………….… 3

圖1-2 MAMP的脂肪酵素水解反應…………………………………... 4

圖1-3 AMPA的脂肪酵素水解反應…………………………………… 4

圖2-1 脂肪水解酵素的不同反應……………………………………..14

圖3-1 固定化擔體合成設備裝置……………………………………..19

圖3-2 聚甲基丙烯醯胺合成反應式……………………..……………20

圖3-3 為共聚物經改質、活化和酵素鍵結之示意圖…………………22

圖3-4 MAMP的合成反應式…………………………………………..22

圖5-1 Pseudomonas fluorescens IFO 12055的菌體生長曲線………46

圖5-2 菌體吸光值對乾菌重圖………………………………………..46

圖5-3 固定化酵素置備時，酵素loading量對單位固定量、活性回收率之影響……………………………………………………….49

圖5-4 酵素液保存於不同溫度下，活性變化情形……………………49

圖5-5 自製MAMP之GC mass圖…………...………………...……..50

圖5-6 自製MAMP之NMR圖…………………………...……...……51

圖5-7 MAMP的HPLC圖，上圖：標準品、下圖：自製品……………..52

圖5-8 MAMP經酵素水解後產生AMPA的HPLC圖，上圖：標準品、下圖：自製品…………………………………………………..53

圖5-9 AMPA的光學分析，Chiral column的HPLC圖………………54

圖5-10 自由酵素於不同pH值下的活性表現………..……………....55

圖5-11 固定化酵素於不同pH值下的活性表現……………………..55

圖5-12 固定化酵素於低pH值下失活的程度………………………..56

圖5-13 自由酵素於不同溫度下的活性表現………………………....56

圖5-14 固定化酵素於不同溫度下的活性表現………………….…...57

圖5-15 固定化酵素於不同shaker轉速下的活性表現………………57

圖5-16 不同MAMP初始濃度對反應速率之影響（自由酵素）……..58

圖5-17 自由酵素之Lineweaver-Burk plot…………………………..58

圖5-18 不同MAMP初始濃度對反應速率之影響（固定化酵素）…..59

圖5-19 固定化酵素之Lineweaver-Burk plot………………………..59

圖5-20 MAMP自然水解反應…………………………………………60

圖5-21 AMPA自然水解反應………….………………………………60

圖5-22 25℃下的反應速率常數……………………………………….61

圖5-23 50℃下的反應速率常數……………………………………….62

圖5-24 25℃下AMPA產率的simulation與experiment……………..63

圖5-25 50℃下AMPA產率的simulation與experiment……………63

圖5-26 50℃下AMPA產率的simulation與experiment……………64

圖5-27 不同MAMP起始濃度，對AMPA產率的影響………………64

圖5-28 調控pH對AMPA產率的影響……………………….………65

圖5-29 有機溶劑與界面活性劑的添加對酵素活性的影響…………65

圖5-30 不同MAMP起始濃度在添加界面活性劑的環境下對酵素活性的影響……………………………………………………..66

圖5-31 固定化酵素在最適反應條件下長期批次反應的穩定度（25mM MAMP）……………………………………..…….66

圖5-32 固定化酵素在最適反應條件下長期批次反應的穩定度（125mM MAMP）…………………………………..…….67

圖5-33 固定化酵素在最適反應條件下放大5倍的長期批次反應的穩定度（25mM MAMP）……………………………………….67

表目錄

表2-1 不同固定化方法之優缺點比較………………………………... 7

表2-2 目前常見之各種擔體分類……………………………………... 8

表2-3 結構之改變對光學純度的影響………………………………..12

表2-4 影響反應E值的因素. ………………………………………….16

表5-1 液態培養機中添加glycerol的影響……………………………47

表5-2 液態培養機中添加oleic acid的影響………………………….47

表5-3 固定化擔體之孔隙特性………………………………………..48

表5-4 固定化酵素製備時，酵素loading量對單位固定量、活性回收率之影響……………………………………………………….48

附錄

附錄1 蛋白質濃度之校正曲線………………………………………..75

附錄2 反應物MAMP濃度與HPLC積分面積之校正曲線…………76

附錄3 產物AMPA濃度與HPLC積分面積之校正曲線…………….76

附錄4 產物AMPA濃度simulation的公式推導……………………77

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