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研究生： 黃朝裕
Chau Yuh Huang
論文名稱： 壓印式蛋白質微陣列晶片之印台研發
The Research of Protein Well Chip Applied to Micro Array Stamping
指導教授： 曾繁根
Fangang Tseng
錢景常
Ching-Chang Chieng
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 原子科學院 - 工程與系統科學系
Department of Engineering and System Science
論文出版年： 2001
畢業學年度： 89
語文別： 中文
論文頁數： 57
中文關鍵詞： 微陣列 、蛋白質晶片
外文關鍵詞： Protein Well Chip, Micro Array
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    • 生物晶片技術是推動次世代生醫檢測技術革命的關鍵助力，在傳統上，檢測方法為使用機器手臂控制的細針系統是將所要分析的生醫檢體打點於試片上形成陣列接受生醫處理程序，但傳統的點針系統若是要處理超過上千個生醫檢體陣列，需花費數小時，不僅增加檢體保存的難度，也限制同時能打印的試片數量。而用這種方法準備的生醫檢體，不但有相互污染的危險更會造成檢體浪費。
    針對上述的缺點，本研究主要利用微機電製程製作印台來涵養蛋白質，以供給印章壓印時所需的蛋白質，利用印台，可以將多餘的蛋白質保存在其中，不足的時候可以提供出來，是一項不同於以往的嶄新設計。生醫蛋白質晶片不但可以平行且快速的檢測大量的生醫檢體。而且更具備了成本低廉的特性。本研究以微陣列為基礎的生醫檢測方法不僅是一個全新的方法可用來同時偵測成千個生醫檢體，並且擁有極佳的擴展性，且此微陣列的晶片使用便宜的材料以及半導體工業上常用的批次製程，利用台灣成熟的半導體環境使我們造出來的晶片成為成本低廉的可棄式晶片，此一新發展的生醫晶片不但能夠用於蛋白質的分析，也可以應用於DNA序列檢測，新藥品的研發及臨床診斷上。

    摘要…………………………………………………………………I 目錄…………………………………………………………………II 圖目錄………………………………………………………………III 表目錄……………………………………………………………..IV 第一章 緒論………………………………………………………1 1.1 前言………………………………………………………1 1.2 文獻回顧…………………………………………………4 1.2.1 DNA微陣列的介紹…………………………………….4 1.2.2蛋白質微陣列的製造…………………………………7 第二章 以微加工技術改進壓印方法…….…………………….16 2.1利用PVDF膜改進蛋白質壓印………………………….16 2.2 第二代壓印改進方法…………………………………..21 第三章 印台的研發………………………….………….….…….28 3.1 印台研發的動機.……………………….………….…...28 3.2 使用Poly Vinyl Alcoh（PVA聚乙烯醇）的原因….32 3.3 利用PVA製作印台的方法…………………………….33 3.4 Stamp 的製作過程與實體圖………………………….37. 3.5 選擇鋁為印章表面的原因……………………………..40 第四章 製程規劃所完成工作…………….………….………42 4.1 初步實驗結果………………………….………………..42 4.2 結果與討論……………………………………………...51 4.3未來完成工作……………………………………………54 第五章 結論與未來展望………………………………………….55 參考文獻…………………………………………………………...56 圖目錄 圖1-1傳統的蛋白質微陣列製作方法……………….………….2 圖1-2儲存蛋白質的印台…………………………….………….3 圖1-3沾印用的印章………………………………….………….4 圖1-4基因晶片的作用原理與其構造……………….………….5 圖1-5點印完成的DNA微陣列……………………….………….7 圖1-6 hydrogel stamper作用圖…………………….………..9 圖1-7傳統光化學微加工製程圖………………………..………10 圖1-8 Arylazide Photochemistry詳細製程圖……….……..11 圖1-9 Arylazide Photochemistry作用化學式……….……..11 圖1-10 Arylazide Photochemistry詳細過程圖……….…….12 圖1-11 Arylazide Photochemistry作用反應式……….…….12 圖1-12 Nitrobenzyl Photochemistry作用過程圖…….…….13 圖1-13 Nitrobenzyl Photochemistry反應式………….…….13 圖1-14 Diazirine Photochemistry詳細過程………….…….14 圖1-15 Diazirine Photochemistry反應式……………………14 圖2-1 BSA蓋印在PVDF因為未使用不織布西去多餘水分……17 圖2-2 施加的力道以及工具使用正確，所得到較好的影像….17 圖2-3 幫助壓印的輔助工具…………………………………….17 圖2-4 BSA蓋印在PVDF膜上濃度與時間比較圖…………..…18 圖2-5 BSA蓋印在在Phast Gel膜上時間與濃度的比較圖.…19 圖2-6 BSA蓋印在Phast Gel上的強度與時間關係曲線圖….19 圖2-7 玻片上面塗佈APTS＋BS3（可鍵結蛋白質）……..….22 圖2-8 OVA蛋白質蓋印到塗佈APTS+BS3玻片的示意圖..…..22 圖2-9 馬血清固定OVA蛋白質………………….…………….23 圖2-10 加第一次抗體示意圖………………..…………….….23 圖2-11 清洗第一次抗體的示意圖……………………………..24 圖2-12 接上二次抗體示意圖………………………..………..24 圖2-13 使用螢光顯微鏡激發FITC的螢光示意圖………….…25 圖2-14透過CoolSnap擷取獲得的二次抗體螢光發光圖….…26 圖2-15 由數位相機所拍得的二次抗體(FITC)螢光發光圖……26 圖3-1-1 因含太多蛋白質而蓋印失敗的影像圖…………….…28 圖3-1-2 含蛋白質液體量太少，導致只有邊緣含有蛋白質….29 圖3-2 利用印台吸收蛋白質多餘，蓋印出完整的圖形….…29 圖3-3 PVA印台的實際成品圖…………………………………..31 圖3-4 PVA薄膜詳細製程圖……………………………………..34 圖3-5 PVA薄膜的SEM上視圖照片與其立體圖示……………..35 圖3-6 不含PVA薄膜的矽基材表面照片………………………..36 圖3-7 含有10微米PVA薄膜的SEM橫切面照片……………….36 圖3-8 印章製程圖,包含印章的製程以及壓印的示意圖 ……..38 圖3-9 印章實體圖………………………………………………..39 圖3-10 1mg/ml BSA在鋁上的接觸角約22度…………………..40 圖3-11 0.1mg/ml BSA 在PMMA上的接觸角圖………………….40 圖3-12 1mg/ml BSA在鋁上的接觸角…………………………….41 圖4-1–1 BSA 蓋印於乾的PVDF膜上-失敗………………………42 圖4-1-2 經過吸收過多餘水分的蓋印圖-成功………………….42 圖4-1-3 蛋白質經過水洗…………………………………………43 圖4-2以竹筷沾印BSA於浸泡過酒精的PVDF上的耐久測試.…44 圖4-3以海綿印章蓋印BSA於phast gel(凝膠)上………….45 圖4-4 PVA印台上視圖………………………………………...47 圖4-5 OVA經過水洗6小時之後的螢光強度圖……………….48 圖4-6 由GenePix 4000B激發得到的螢光影像圖……………50 表目錄 表4-1 各種表面蛋白質鍵結比較圖……………………………….52 表4-2 本實驗與文獻作法比較…………………………………….53

    參考文獻
    (1)許志英，”DNA 微陣列”，SCIENCE MONTHLY 9(1999) pp.720-725.
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    (7) L.G. Mendoza, et al., “High-Throuhput Microarray-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)” ,Biotechniques 27(1999) pp.778-788.
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    and Micro-wells For Disease Diagonosis and Drug Screening ”
    FJAC 2001
    (10) F. G. Tseng, H. M. Huang, C. S. Liu, C. Y. Huang, S. C. Lin, and C. C. Chieng, “Micro Protein Arrays Prepared by Microfabricated Stamps”, MEMS' 2000, MEMS-vol. 2, ASME IMECE 2000, pp. 659-665, Florida, Nov. 5-10, 2000.
    (11)Fan-Gang Tseng, Haimei Huang, Chang-Sheng Liu, Chau-Yuh Huang, Ching-Chang Chieng, “Size Effect on Surface Tension and Contact Angle between Protein Solution and Silicon Compound Substrates”, Engineering Foundation Conference Heat Transfer and Transport Phenomena in Microsystems, Banff, Canada, October 15 - 20, 2000.

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