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研究生： 顏名汝
論文名稱： 利用二維核磁共振光譜探討人類鹼性纖維母細胞生長因子與小分子藥物及Syt1 C2A區域之交互作用
指導教授： 余靖
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 理學院 - 化學系
Department of Chemistry
論文出版年： 2007
畢業學年度： 95
語文別： 中文
論文頁數： 56
中文關鍵詞： 人類鹼性纖維母細胞生長因子 、血管新生 、非古典路徑
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    • 近年來，癌症一直高居國人十大死因之首。癌細胞最可怕的能力是藉由自行新生血管，亦即一般所熟知的血管新生作用 (angiogenesis)，擴散、侵犯其他組織。血管新生作用不但是正常生理變化所必需有的過程，近年來科學家們也發現它和癌症的發展有密切的關係。體內促使血管新生的物質很多，鹼性纖維母細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF or FGF-2) 則是目前被研究較多的血管新生物質之一。此外，針對阻斷腫瘤細胞自行製造血管能力的藥物不斷開發出來，用以阻斷腫瘤細胞自行製造血管的能力，減緩或中止癌細胞的擴散。在此，本實驗室選擇以suramine作為研究材料，因為它是眾多抗血管新生藥物中，研究最為透徹的一個。為了闡明sruamine與FGF-2之間作用的情形，本實驗室利用二維核磁共振光譜來探討suramine如何透過與FGF-2結合，近而抑制FGF-2刺激血管新生的功能。
    另外，許多分泌型蛋白質由細胞製造後，藉由訊號肽的帶領，經由古典路徑─即內質網及高基氏體中介的路徑，釋出細胞膜外，執行其功能。但近年來發現一些缺乏訊號肽的蛋白質，如酸性纖維母細胞生長因子 (aFGF or FGF-1) 及FGF-2等，亦會藉由尚未確知的機制釋出細胞外。正由於釋出機制不明確，這些缺乏訊號肽蛋白質的釋出機制是一塊相當值得探討的領域。目前已得知，FGF-1會和p40-Syt1-S100A13形成複合體而釋出細胞膜外，但是關於FGF-2釋出細胞膜外機制仍不如FGF-1明確。由於兩者皆屬於FGFs中缺乏訊號肽的成員，故本實驗室利用二維核磁共振光譜探討FGF-2與Syt-1之C2A區域結合情形，試看FGF-2是否遵循與FGF-1相同之釋出機制，分泌至細胞外。

    第一章、緒論 1 第一節、前言 1 第二節、關於FGF-2及其結構 2 第三節、hFGF-2與Heparin的結合 5 第四節、hFGF-2與其接受器 10 第五節、一些抑制癌細胞生長之藥物 13 第六節、hFGF-2與非古典路徑及細胞內傳遞路徑 18 第二章 實驗部份 22 第一節、使用儀器 22 第二節、藥品配製 24 第三節、實驗方法 29 第一部分、hFGF-2 蛋白質的取得 29 一、hFGF-2蛋白質的表現 (Expression) 29 二、hFGF-2蛋白質的純化 (Purification) 30 三、hFGF-2蛋白質的去鹽及濃縮 32 四、hFGF-2蛋白質濃度之測定 33 第二部分、hFGF-2蛋白質基本性質之鑑定 33 第三部分、15N-labeled hFGF-2蛋白質的取得 34 第四部分、hFGF-2與Suramine交互作用之實驗 35 一、NMR實驗 35 二、恆溫滴定熱卡計 (ITC) 實驗 35 第五部分、hFGF-2與Syt1之 C2A區域交互作用之實驗 36 第三章、結果與討論 37 第一節、hFGF-2蛋白質的取得及基本性質之鑑定 37 第一部分、hFGF-2蛋白質的表現 37 第二部份、hFGF-2蛋白質的純化 38 第三部分、hFGF-2蛋白質分子量之鑑定 40 第二節、hFGF-2與Suramine交互作用之探討 43 第一部份、NMR實驗 44 第二部份、恆溫滴定熱卡計實驗 (ITC) 48 第三節、hFGF-2與Syt1之C2A區域交互作用之探討 49 第四章、結論 54 第五章、參考文獻 55 圖目錄 圖1-1：TypeⅠ及typeⅡ reverse turn 3 圖1-2：hFGF-2之NMR結構與X-ray結構的疊合圖形 4 圖1-3：hFGF-2與heparin結合之主要區域 5 圖1-4：hFGF-2的表面電子雲圖 6 圖1-5：Heparin重複雙醣單元的化學結構 7 圖1-6：Heparin NMR結構 7 圖1-7：hFGF-2與六碳醣模擬之heparin結合 9 圖1-8：酪胺酸激酶接受器及下游活化反應 10 圖1-9：FGF-2-heparin-FGFR1複合體之X-ray結構 11 圖1-10：Doxorubicin之結構式 13 圖1-11：Carboplatin與Cisplatin之結構式 14 圖1-12：Vinblastine之結構式 15 圖1-13：Paclitaxel與Docetaxel之結構式 16 圖1-14：蛋白質在細胞內「定位」示意圖 18 圖1-15：內膜系統蛋白質或分泌型蛋白質被帶到內質網的示意圖 19 圖1-16：SRP-核醣體複合體與SRP接受器及蛋白質通道 19 圖1-17：無訊號肽蛋白質釋出細胞膜外機制以及使用該機制之蛋白質 20 圖3-1：WT hFGF-2與hFGF-2 mutant胺基酸序列之比較 37 圖3-2：SDS-PAGE of hFGF-2 large scale expression 38 圖3-3：LC profile of hFGF-2 purification 39 圖3-4：SDS-PAGE of hFGF-2 purification 39 圖3-5：HPLC profile of hFGF-2 de-salting 40 圖3-6：ESI-Mass spectrum of hFGF-2 41 圖3-7：FGF-2之1H-15N HSQC圖譜 42 圖3-8：Suramine之結構式 43 圖3-9：hFGF-2 : Suramine = 1:0.6之1H-15N HSQC圖譜 44 圖3-10：hFGF-2 : Suramine = 1 : 0.6 之1H-15N HSQC部份放大圖譜 45 圖3-11：hFGF-2的3D結構以及與suramine結合的胺基酸 45 圖3-12：hFGF-2 : Suramine = 1 : 0.8之1H-15N HSQC圖譜 46 圖3-13：hFGF-2 : Suramine = 1 : 4之1H-15N HSQC圖譜 47 圖3-14：ITC profile of hFGF-2 & suramine interaction 48 圖3-15：hFGF-2與C2A作用之1H-15N HSQC圖譜 50 圖3-16：hFGF-2與Syt1 C2A區域作用後各胺基酸peak intensity變化 51 圖3-17：hFGF-2與Syt1 C2A區域作用後各胺基酸chemical shift變化 51 表目錄 表1-1：FGF family與heparin結合區域胺基酸序列之比對 8 表1-2：FGF-2與FGFR1、FGFR2作用之胺基酸 12

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