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研究生： 魏明正
Wei Ming Cheng
論文名稱： DNA與樹枝狀高分子形成奈米微粒結構分析與基因表現之探討
指導教授： 宋信文
Song Xin Wen
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 工學院 - 化學工程學系
Department of Chemical Engineering
論文出版年： 2008
畢業學年度： 96
語文別： 中文
論文頁數： 54
中文關鍵詞： 樹枝狀高分子
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    • Dendrimer具樹枝狀的結構，可作為新穎的基因載體。本實驗利用Dendrimer結構上帶有大量的胺基，製備三種不同質子化程度的Dendrimer，分別為dp=0.1、dp=0.3及dp=0.9與直鏈狀DNA (pEGFP-N2)形成奈米微粒後，以小角度散射分析其內部結構。其中dp=0.1的奈米微粒內部結構呈現平面四角形，dp=0.3呈現平面四角形與不規則共存形態，dp=0.9屬於完全不規則的分佈形態。除此之外，亦分析其粒徑大小、表面電荷及TEM粒子形態。接著以此三種內部結構的奈米微粒進行HT1080細胞轉染實驗，結果顯示dp=0.3的奈米微粒相較於dp=0.1與dp=0.9有較高的細胞轉染效率與基因表現量。再利用FITC接枝於Dendrimer表面胺基上，用以追蹤奈米微粒被細胞吞食的情形，結果顯示細胞吞噬較多dp=0.3的奈米微粒。最後為探討奈米微粒胞飲的機制，以抑制劑wortmanin抑制macropinocytosis及Filipin、MβCD、Genistein抑制caveolin-dependent endocytosis後，可以降低細胞吞食奈米微粒的能力，尤其以dp=0.3的效果較為顯著。更進一步的研究，則以anti-caveolin-1的抗體標定細胞，發現caveolin確實參與了Dendrimer/DNA奈米微粒的胞飲過程。以上的實驗結果，顯示Dendrimer/DNA奈米微粒的幾何形狀會影響到基因轉染的效率。

    目錄 目錄 I 圖目錄 V 表目錄 VIII 摘要 1 第一章 緒論 2 1-1樹枝狀高分子的介紹 3 1-1-1 Dendrimer的起源與發展 3 1-1-2 Dendrimer的結構與特性 3 1-1-3 Dendrimer的合成方法 5 1-1-4 Dendrimer於生物醫學方面的應用 6 1-2基因傳遞 6 1-2-1基因治療的觀念 6 1-2-2基因傳遞的路徑與限制 7 1-2-3利用Dendrimer做為基因傳遞載體 10 第二章 研究目的及動機 11 第三章 Dendrimer/DNA奈米微粒特性分析 13 3-1實驗材料 13 3-1-1 Dendrimer 13 3-1-2報導基因 13 3-1-3質體純化組 14 3-1-4限制酵素 15 3-2實驗方法 16 3-2-1環狀的質體DNA的製備 16 3-2-2 DNA濃度測定 18 3-2-3製備直鏈狀DNA 18 3-2-4不同質子化程度的Dendrimer與DNA形成奈米微粒 19 3-2-5小角度分析Dendimer與DNA的結構關係 20 3-3 結果與討論 20 3-3-1 SIZE與ZETA 20 3-3-2小角度散射分析 22 3-3-3 TEM 24 3-3-4 Gel retardation assay 24 3-3-5包覆率 25 第四章 HT1080細胞轉染實驗 28 4-1實驗材料 28 4-1-1細胞來源 28 4-2實驗方法 28 4-2-1細胞轉染實驗(transfection) 28 4-2-2單顆細胞的分離與固定 29 4-2-3轉染效率 30 4-2-4螢光強度分析 30 4-2-5比較不同Dendrimer/DNAN/P ratios的奈米微粒之轉染效率 31 4-2-6比較不同DNA劑量的Dendrimer/DNA奈米微粒之轉染效率 31 4-2-7比較不同內部結構的Dendrimer/DNA奈米微粒之轉染效率 31 4-2-8不同時間點EGFP基因在細胞之表現 32 4-2-9細胞活性測試 32 4-3 結果與討論 33 4-3-1基因轉染效率 33 4-3-2綠色螢光基因表現 37 4-3-3不同時間點，不同結構奈米微粒EGFP基因表現情形 38 4-3-4細胞活性分析 39 第五章 胞飲機制探討 41 5-1實驗材料 41 5-1-1螢光物質 41 5-1-2細胞抑制劑 41 5-2實驗方法 42 5-2-1共軛焦倒立式顯微鏡 42 5-2-2抑制劑與細胞胞飲作用 42 5-2-3 Dendrimer/DNA奈米微粒與caveolin的關係 42 5-3 結果與討論 43 5-3-1細胞吞噬作用分析 43 5-3-2細胞抑制劑 47 5-3-3 Dendrimer/DNA奈米微粒與caveolin的關係 51 第六章 參考文獻 52 圖目錄 圖1-1典型的樹枝狀高分子結構 4 圖1-2 Dendrimer的發散式合成法 5 圖1-3 Dendrimer的收斂式合成法 6 圖1-4非病毒載體 8 圖1-5基因傳遞的路徑 9 圖2-1實驗設計圖 12 圖3-1 pEGFP-N2質體DNA 13 圖3-2細胞表現綠螢光蛋白質 14 圖3-3 A酵素切位 16 圖3-3 B限制酵素作用後的電泳圖 16 圖3-4 pEGFP-N2含有Kanamycin抗藥性的序列 17 圖3-5三種Dendrimer/DNA堆疊模式 22 圖3-6三種不同dp值的Dendrimer/DNA奈米微粒的小角度X光散射分析 23 圖3-7 dp=0.3之奈米微粒TEM圖 24 圖3-8 N/P=10/1三種奈米微粒的穩定性 25 圖3-9 Picogrren在不同N/P ratios奈米微粒的螢光值 26 圖4-1 Dendrimer/DNA在不同N/P ratios的感染效率 33 圖4-2 N/P=10/1與N/P=15/1的細胞形態 34 圖4-3不同劑量的DNA細胞轉染率 35 圖4-4 5 μg與10 μg的細胞形態 35 圖4-5三種結構不同的奈米微粒進行細胞轉染 36 圖4-6不同dp值下Dendrimer/DNA的轉染效率 37 圖4-7不同dp值下Dendrimer/DNA的eGFP表現量 38 圖4-8不同時間點，細胞表現eGFP的情形 39 圖4-9細胞活性結果 40 圖5-1 一小時之FITC-dendrimer/ DNA在細胞胞飲的情形 44 圖5-2二小時之FITC-dendrimer/ DNA在細胞胞飲的情形 44 圖5-3 FITC-dendrimer/DNA由細胞膜進入核膜 45 圖5-4吞噬FITC奈米微粒的細胞百分比 46 圖5-5細胞內FITC的螢光強度 46 圖5-6各種細胞胞飲的路徑 47 圖5-7細胞抑制劑wortamanin對Dendrimer/DNA胞飲的影響 48 圖5-8細胞抑制劑Genstein對Dendrimer/DNA胞飲的影響 49 圖5-9細胞抑制劑Filipin對Dendrimer/DNA胞飲的影響 50 圖5-10細胞抑制劑MβCD對Dendrimer/DNA胞飲的影響 51 圖5-11細胞中Dendrimer/DNA奈米微粒與caveolin的關係 51 表目錄 表3-1 Dendrimer/DNA奈米微粒的大小與電荷性 21 表3-2不同N/P ratios奈米微粒的包覆率 27

    第六章 參考文獻
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