微粒體甲烷單氧化酵素是嗜甲烷菌中分布於細胞內脂質膜中的一種酵素，可將甲烷羥化成甲醇，啟動嗜甲烷菌新陳代謝的進行。其基因的表現受到環境中銅離子濃度所調控，為一富含銅離子之膜蛋白質。
當以對掌性氘氚乙烷和二氘丁烷做為微粒體甲烷單氧化酵素的基質時，所氧化的位置均發生烷烴化合物的二號碳上，且產物的立體組態完全的保留與反應前的一致，表示其sp3的光學活性中心並沒有因反應的發生，使得中間體的配位組態(由四面體轉換成三角平面)發生改變，歸因於此，使我們可以合理地推測此酵素的反應機構，在保持原光學活性組態的前提下，高活性的氧化中間體，極可能牽涉到高活氧原子同步化地直接嵌入甲烷分子中的碳氫鍵，並將之活化成相對應的羥基。然而，當導入不具光學活性的[2,2-2H2]butane分子作為pMMO的反應受質時，我們發現所生成產物的結果，有直接傾向R鏡像結構的生成，但從產物質譜結果的分布比例中，CH3CD2- 端進入疏水基的活性中心的比例卻遠較CH3CH2- 端來的多，我們可以很直覺的想像，當丁烷分子在水中低溶解度的狀況下，酵素反應的模式是處於相對應基質遠比酵素的含量來的少的情況([S] << [E])，其反應速率的呈現可簡單地以rate = (kcat/Km)[S] 表示，其中，kcat值表示活性中心活化C-H鍵的能力，可簡單的以C-H鍵和C-D鍵所呈現的動力學效應校正回來，而基質濃度相對於酵素的濃度質的濃度，則因為是基於同一個分子的比較，應該是維持固定不會改變的，所以，在考慮CH3CD2-端與CH3CH2-端進入活化中心的差異性，應可直接地推導出，其動力學常數Km 在[2,2-2H2]butane相對應於原分子的比值，大約為0.172，這樣的數據顯示由CH3CD2-端進入蛋白分子相較CH3CH2-端應該來的更容易的多 ，這讓我們了解，由於在[2,2-2H2]butane分子中的二號碳上具鍵長較短約0.01Å的C-D鍵，使得分子的凡得瓦半徑較能符合微粒體型甲烷單氧化酵素疏水性催化中心的大小，以形成較緊密的交互作用。這樣的推測，更從以[1,1,1-2H3]butane 以及[1,1,1,4,4,4-2H6]butane的氘丁烷為基質所得到的結果 ，有了更進一步的驗證；在這個實驗中，兩者產物的光學選擇性(enatiomeric excess)的數值分別為94 %和86 %，有利於R鏡像結構的生成，這樣的結果，更再一次顯示，基於疏水性活性空間可以感受到C-D鍵長與C-H鍵長的差異，使得分子在進入活性空間時，彼此交互作用所引導出分子間的動態構形的調整，可感受到前端與末端甲基立體障礙所造成的差異性，進而引發不同立體選擇性的結果。此外，我們更深入的分析[1,1,1-2H3]butane分子在微粒體甲烷單氧化酵素所生成的產物，藉由衍生成多氟酯後的質譜斷裂片段，在考慮二級動力學效應1.0-1.5的狀況下，顯示其動力學常數Km的比值相對應於原分子為0.50-0.73，再一次說明C-D鍵較C-H鍵所造成較短的凡得瓦半徑，使得反應較容易從CD3-進入催化中心的事實。只是末端分子的影響，沒有二號碳的改變來的明顯。此外，為了驗證甲烷單氧化酵素同位素效應的普遍性，我再合成了[2-2H1]propane，經校正了未標定分子的含量，我們推衍出在丙烷分子的同位素效應比值為 kH/kD= 5.79□0.04,其結果和手性乙烷和氘丁烷的羥基化的實驗結果是一致的(kH/kD= 5.2-5.5),也就是說甲烷單氧化酵素的羥基化反應機構是將側面的” oxoene“將氧原子嵌入碳氫鍵羰氫化,如一般的亞碳機的嵌入反應。
最後，我們將反式二丁烯導入微粒體甲烷單氧化酵素中進行環氧化反應，並計算其產物反式-2,3-二甲基環氧乙烷之e.e.值為10.2 %，立體位向傾向(2S,3S)的結構。這說明了在微粒體甲烷單氧化酵素中，乙烯基碳的環氧化反應並不如羥化反應有高的鏡像選擇性，也進一步指出sp3混成的分子軌域比sp2混成的分子軌域在微粒體甲烷單氧化酵素中，更可以形成一個較好的催化立體位向。

Abstract
Various deuterated propanes and butanes have been synthesized to serve as mechanistic probes to explore the C-H hydroxylation occurring at the hydrophobic pocket within the particulate methane monooxygenase (pMMO) from M. capsulatus (Bath). The enantiomeric excess (ee) of the oxidation products for [1,1,1-2H3]butane and [1,1,1,4,4,4-2H6]butane was determined to be 94% and 86%, respectively, in favor of the formation of the 2R-alcohol. According to our previous experiment, in the case of [2,2-2H2]butane, the insertion of the CH3CD2- end was more favorable than the CH3CH2- end due to the tightness of the hydrophobic pocket. The van der Waal radius of the C-D bond is about 0.01 Å shorter than that of C-H bond. Therefore, the different ee value between [1,1,1-2H3]butane and [1,1,1,4,4,4-2H6]butane may simply reflect the higher steric hinderance of 4-CH3- end of [1,1,1-2H3]butane adjacent to the edge of the hydrophobic pocket. This steric effect may control the stereochemistry in order to bias the hydroxylation toward the R-alcohol at the 4-CD3- end. From GC-MS analysis of m/z 141 and 144 ratio of the correponding trifluoroacetic ester derivatives of [1,1,1-2H3]butan-2-ol products we measured, we obtained kCH3-/kCD3-= 0.73(0.01), indicating that the insertion is in preference for the CD3CH2- end relative to CH3CH2- end. In the case of [2-2H1]propane, we measured a modest kinetic isotope effect (KIE) of hydrogen vs. deuterium of 5.79(0.04), in full agreement with KIE value previously determined for cryptically chiral ethane and d.l-chiral butane (5.5). These data provide further support for the concerted oxene insertion instead of radical rebound mechanism in the hydroxylation reaction of propane molecule mediated by pMMO. Finally, we conducted experiments on the oxidation of the trans-2-butene by pMMO. The enantiomeric excess of the products trans-2,3-epoxybutane was determined to be 10.2% in favor of (2S,3S)-products. The epoxidation of vinylic carbon mediated by pMMO does not give rise to the same high chiral selectivity in comparison with the hydroxylation of the aliphatic compound. This result indicates that the sp3 carbon center encounters a stronger stereoelectronic orientation relative to the sp2 carbon center at the active site.

1. Schmid A.; Dordick J.S.; Hauer B.; Kiener A.; Wubbolts M.; Witholt B. Nature 2001, 409, 258-268
2. Straathof, A. J.J.; Panke, S.; Schmid, A. Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13, 548-556
3. Holland, H. L.; Weber, H. K. Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11, 547-553
4. de Vries, E. J.; Janssen, D. B. Curr. Opin. Biotechnol. 2003, 14, 414-420
5. Hanson, R. S.; Hanson, T. E. Microbiol. Rev. 1996, 60, 439-471.
6. Anthony, C. The Biochemistry of Methylotrophs; Academic Press: New York, 1982, pp 17
7. Colby, J.; Stirling, D. I.; Dalton, H. Biochem. J. 1977, 165, 395-402
8. Nguyen, H.-H. T.; Elliott, S. J. Yip, J. H.-K.; Chan, S. I. J. Biol. Chem. 1998, 273, 7957- 7966
9. Elliott, S. J.; Zhu, M.; Tso, L.; Nguyen, H.-H. T.; Yip, J. H.-K.; Chan, S. I. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 994□□□955
10. Newcomb, M.; Shen, R.; Lu, Y.; Coon, M. J.; Hollenberg, P. F.; Kopp, D. A.; Lippard, S. J. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 6879-6886
11. Liu, K. E.; Johnson, C.C.; Newconb, M.; Lippard, S. J. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 939-947.
12. Choi, S.-Y.; Eaton, P. E.; Kopp, D. A.; Lippard, S. J.; Newcomb, M.; Shen R. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 12198-12199.
13. Yu, S. S.-F.; Wu, L.-Y.; Chen, K. H.-C.; Luo, W.-I.; Huang, D.-S.; Chan, S. I. J. Biol. Chem. 2003, 278, 40658-40669.
14. Yu, S. S.-F.; Chen, K. H.-C.; Tseng, M. Y.; Wang, Y.-H.; Tseng, C.-F.; Chen, Y.-J.; Huang, D.-S.; Chan, S. I. J. Bacteriol. 2003, 185, 5915-5924.
15. Wilkinson, B.; Zhu, M.; Priestley, N. D.; Nguyen, H.-H. T.; Morimoto, H.; Williams, P. G.; Chan, S. I. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 921-922.
16. Valentine, A. M.; LeTadic-Biadatti, M.-H.; Toy, P.-H.; Newcomb, M.; Lippard, S. J. J. Biol. Chem. 1999, 274, 10771-10776.
17. Carrol, F. A., Perspective on structure and mechanism in organic chemistry; Brooks Cole: Florence, 1997.
18. Kohen, A.; Jonsson, T.; Klinman, J. P. Biochemistry. 1997, 36, 2603-2611.
19. Seymour, S.; Klinman, J. P. Biochemistry. 2002, 41, 8747-8758.
20. Bahnson, B. J.; Klinman, J. P. Methods Enzymol. 1995, 249, 373-397.
21. Huang, D.-S., Wu, S.-H., Wang, Y.-S., Yu, S. S.–F. and Chan S. I. ChemBioChem, 2002, 3, 76□□□65.
22. Chan, S. I.; Chen, K. H.-C.; Yu, S. S.-F.; Chen C.-L.; Kuo, S. S.-J. Biochemistry. 2004, 43, 4421-4430.
23. Information of hollow fiber is brought by Mitsubishi Rayon Co., Ltd
24. Valentine, A. M.; Wilkinson, B.; Liu, K. E.; Komar-Panicucci, S.; Priestley, N. D.; Williams, P. G.; Morimoto, H.; Floss, H. G.; Lippard, S. J. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1818-1827.
25. a) Helmkamp, G. K; Rickborn, B. F. J. Org. Chem. 1957, 22, 47□□□82; b) Krishnamurthy, S.; Brown, H. C. J. Org. Chem. 1976, 41, 306□□□066.
26. Schurig, V.; Koppenhoefer, B.; Buerkle, W. J. Org. Chem. 1980, 45, 538-541
27. Seeley, D. A.; McELWEE, J. J. Org. Chem. 1973, 38, 1691-1693.
28. Hill, R. K.; Rhee, S.-W.; Leete, E.; McGaw, B. A. J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 7344-7348.
29. Baik, M.-H.; Newcomb, M.; Friesner, R. A.; Lippard, S. J. Chem. Rev. 2003, 103, 2385-2419.
30. Bell, S. G.; Stevenson, J.-A.; Boyd, H. D.; Campbell, S.; Riddle, A. D.; Orton, E. L.; Wong, L. L. J. Chem. Soc. Chem. Comm. 2002, 490.
31. Glieder, A.; Farinas, E. T.; Arnold, F. H. Nat. Biotech. 2002, 20, 1135.