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研究生： 曾詠欽
Tzeng, Yung-Chin
論文名稱： 整合式微流體精子分選及卵子培育 系統並應用於人工試管嬰兒技術
INTERGRATED MICROFLUIDIC SPERM SORTING AND OOCYTE INCUBATION SYSTEM FOR IN-VITRO FERTILIZATION ENHANCEMENT
指導教授： 曾繁根
Tseng, Fang-Gan
口試委員: 蘇育全
Su, Yu-Chuan
杜清富
Tu, Chin-Fu
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 原子科學院 - 工程與系統科學系
Department of Engineering and System Science
論文出版年： 2018
畢業學年度： 106
語文別： 中文
論文頁數： 73
中文關鍵詞： 微流體 、精子分選 、卵子培育 、漸擴式流場 、液體交換系統 、輔助生殖技術
外文關鍵詞： microfluid, sperm sorting, oocyte incubation, divergent flow field, fluid exchanging system, assist reproductive technique
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    • 根據衛福部資料統計，在台灣約有10~15%的育齡期夫妻受不孕症的困擾，而美國國家疾病管制局(Centers for Disease Control and Prevention)統計指出，在美國約有11％的女性在生育年齡面臨懷孕困難，甚至是不孕症。在台灣受到不孕症困擾的夫妻之中有98.7%都是使用試管嬰兒技術，但在民國103年台灣的體外受精技術（IVF）成功懷孕率卻只有33％，造成低成功率的原因有二：1. 傳統生物實驗室利用離心方式分選活動力好的精子，但離心力會對精子產生殺傷力，導致可用的精子量急劇減少，並影響存活精子的品質。2. 傳統生物醫學實驗室的卵細胞透明帶(Zona)去除的過程非常繁雜，卵細胞前後需經過至少8次的轉移，為了將酵素對卵細胞的傷害降到最低，因此完成單一顆卵子透明帶去除的過程約耗時30分鐘，而利用取卵針直接吸取卵細胞且頻繁的移動卵細胞也很容易對卵細胞產生傷害。因此本研究開發一種三維結構微流體晶片，提出了一個漸擴流場的機制能夠以更溫和的方式分選出高效能精子，同時提出液體交換系統用以完成卵子透明帶去除過程並且一次固定多顆卵細胞位置，並以置換流體的方式代替轉移卵子的過程，且此晶片可以將檢體(精子和卵子)前置處理作業時間簡化至只約需30分鐘。本研究利用高分子材料(PDMS)做為晶片材料，除了生物相容性高，外觀透明適合於醫學檢測、價格較低，晶片製作方便，這些優點將有效降低以往人工試管嬰兒檢體製備所需時間以及成本。

    This paper proposes an integrated microfluidic sperm sorting and oocyte incubation system for high efficient in-vitro fertilization application. The device consists of a high-quality sperm sorter and an oocytes zona-removal incubation device interconnected on a 3D IVF chip for promoting the successful rate and the efficiency of In-vitro fertilization (IVF). The chip can select high portion of high-quality sperms and carry out zona-removal process gently simultaneously in thirty minutes. Experiment results showed this chip not only provides an easier and faster procedure to sort out motile sperms, better preserves the viability of zona-free oocytes, and successfully fertilizes the oocytes even grows to two cells.

    總目錄 摘要 II ABSTRACT III 致謝 IV 總目錄 V 表目錄 IX 第一章 緒論 1 1.1 研究背景 1 1.1.1 微機電系統 1 1.1.2 微流體生醫晶片 2 1.2 研究動機 3 第二章 文獻回顧 6 2.1 晶片內部微流體層流之特性 6 2.1.1 以穩定層流分離精子 6 2.1.2 利用精子本身活動力分選 9 2.2 逆向流場 11 2.2.1 利用精子逆流的特性分選具活動力的精子 11 2.2.2 漸擴流場 14 2.3 以微流體晶片做卵細胞捕捉及培育 16 2.3.1 卵細胞捕捉定位 16 2.3.2 微流體交換系統 18 2.4 研究目的 21 第三章 晶片分析 24 3.1 流道設計 24 3.2 理論值計算 28 3.2.1 精子分選流道流速計算 28 3.2.2 精子分選流道壓力計算 31 3.2.3 濃度稀釋計算 35 3.3 晶片製程 36 3.3.1 黃光微影製程 36 3.3.2 軟微影製程 40 3.3.3 PDMS表面修復改質 42 3.4 實驗儀器 43 3.4.1 實驗藥品 43 3.4.2 實驗儀器 44 3.4 實驗過程 46 3.4.1 檢體來源 46 3.4.2 母倉鼠誘導排卵 47 3.4.3 晶片滅菌及潤濕 48 3.4.4 卵子透明帶去除 48 3.4.5 精子檢體載入晶片 48 3.4.6 精卵結合 48 第四章 結果與討論 50 4.1 晶片製作 50 4.1.1 黃光微影母模製作 50 4.1.2 PDMS多孔薄膜製作結果 51 4.1.3 PDMS晶片製作結果 52 4.2 晶片測試 53 4.2.1 導流道流速測試 53 4.2.2 培養槽擴散速率測試 56 4.2.3 精子檢體載入晶片測試 57 4.2.4 PDMS多孔薄膜過濾精液 58 4.2.5 計算機輔助精子分析儀校正 58 4.2.6 Cell Tracking計算流體流速及精子絕對游速 60 4.2.7 分析分選之精子活動力 61 4.2.8 卵子檢體載入晶片測試 63 4.2.9 精卵結合測試 64 第五章 結論與展望 68 5.1 結論 68 5.2 未來工作 69 5.2.1 晶片射出成型 69 5.2.2 改變多孔薄膜材質 69 第六章 參考文獻 70 圖目錄 圖 1、體外受精技術(IVF)示意圖 4 圖 2、卵丘細胞與透明帶去除過程示意圖與透明帶去除後之卵細胞 5 圖 3、(A)紊流流場不可預測 (B)層流流場可預測 [9] 6 圖 4、J.C. Li亦提出穩流概念 7 圖 5、Chen et al.在2013所提出的實驗設計 10 圖 6、精子達平衡所需時間[15] 10 圖 7、D.B. Seo et al.之概念工作原理示意圖及流道設計圖 11 圖 8、D.B.Seo et al.分別使用(a)牛和(b)小鼠的精子證實精子會抵控流場 11 圖 9、高度差大於1 mm時在流道B內流場方向不同 12 圖 10、(a)為初始樣本 (b)分選後具活動力的精子比例明顯增加 12 圖 11、Chen et al.所設計的流道概念示意圖 13 圖 12、精子是否通過可藉由觀測產生的訊號值判斷 13 圖 13、Chen et al.實驗結果顯示濃度越高訊號越強 14 圖 14、Chen et al.在2013年提出的漸擴流場概念 15 圖 15、藉由螢光觀測精子分群 16 圖 16、結合PDMS與耐熱玻璃所製作之胚胎培養流道[7] 17 圖 17、微型鑷子結構與微型鑷子捕捉細胞顯微鏡圖[8] 17 圖 18、(a)PDMS主要流道結構示意圖；(b)PDMS凹槽陣列示意圖；(c)PDMS流道側視圖，精子因重力作用而進入凹槽；(d)、(e)晶片圖與凹槽陣列結構顯微鏡圖[11] 18 圖 19、上圖顯示出不同深度之凹槽產生之渦流狀況；下圖顯示利用此結構來清卵細胞周圍殘渣的過程 18 圖 20、微流體環境中價上阻塊產生渦流 19 圖 21、(a)三維胚胎培養晶片結構；(b)微流體環境中濃度擴散模擬； 19 圖 22、孔徑200 μm深度200 μm之孔洞薄膜SEM俯視圖及截面圖 20 圖 23 、卵細胞落在陷阱中，可由此追蹤單一卵細胞 20 圖 24、三維結構晶片利用perfusion進行液體交換 20 圖 25、流道設計上視圖 25 圖 26、白努利定律推導模型 32 圖 27、透明帶去除後清洗過程示意圖 35 圖 28、SU8光阻厚度與其應設定之轉速對照圖 37 圖 29、SU8 光阻厚度與其對應之曝光劑量 39 圖 30、母模製程說明圖 40 圖 31、孔洞薄膜製程示意圖 41 圖 32、PDMS孔洞薄膜以外區域進行二次PDMS塗佈完成照片 42 圖 33、30μm多孔薄膜與200μm多孔薄膜經過氧電漿處理後接合 42 圖 34、雙面對準曝光機 44 圖 35、α-step surface profilometer 44 圖 36、Reactive Ion Etching 45 圖 37、SEM JEOL JSM-6330F 45 圖 38、Syringe Pump及顯微鏡 46 圖 39、(a)卵巢、輸卵管與其周圍脂肪組織之顯微鏡圖(b) 去除卵丘細胞後的卵細胞 47 圖 40、光學顯微鏡所拍攝之流道、柱子陣列結構圖 50 圖 41、PDMS多孔薄膜進行乾蝕刻前後之俯視圖 51 圖 42、PDMS複合薄膜之SEM俯視圖及截面圖 52 圖 43、PDMS晶片缺陷示意圖 52 圖 44、PDMS薄膜面積延展 53 圖 45、接合完成之PDMS整合式晶片 53 圖 46、COMSOL模擬軟體對於流道內流速進行模擬 54 圖 47、以對稱的方式均分寬度100 μm之導流道示意圖 54 圖 48、導流道內不同流線之流速 55 圖 49、流量變化對完成稀釋機制所需的時間 56 圖 50、原液中經常有大於50μm的大型團塊 57 圖 51、PDMS箔膜過濾精液中的雜質團塊 58 圖 52、CASA分析靜止液體及流動液體中的精子之差異 59 圖 53、利用Cell Tracking計算流體中的自由粒子以及逆游精子的位移量 60 圖 54、利用CASA分析分選前後的精子總數、良好精子、優越精子、以及劣質精子數 61 圖 55、利用百分比表示分選前後，優質精子與劣質精子的百分比 62 圖 56、精子經過單次分選後，游速可從53.5 μm/s提升至79.7 μm/s 62 圖 57、多次分選後的精子經雙重染色後計算死活比例 63 圖 58、執行透明帶去除前後比較圖 64 圖 59、(a)以光學顯微鏡觀察到無透明帶卵子周圍有許多精子(b)以DAPI染色可以觀察到精子貼附在卵子表面，但無入卵之直接證據 65 圖 60、卵子內部出現兩個原核，證明精子確實入卵 66 圖 61、卵內出現一個或多個原核皆可被認為精子成功入卵 66 表目錄 表 1、人工協助生殖技術整理列表 3 表 2、經過分選後，高效能精子聚集於蒐集區[13] 7 表 3、粒線體膜電位比例[14] 8 表 4、傳統方法與微流體晶片對於IVF的比較[14] 9 表 5、不同流道寬度所對應的流速值 31 表 6、不同流道寬度所對應的流體壓力值 34 表 7、光阻旋佈參數 38 表 8、四種母模之預期厚度與其對應之曝光劑量 39 表 9、四種母模之預期厚度與其實際成品厚度 51 表 10、以曲線擬合得到完成稀釋機制所需的時間 57 表 11、流動液體之流速以及逆游精子的相對游速 60 表 12、不同批次卵子肢體外成熟率 65 表 13、豬精卵結合實驗所有卵子的受精率 67

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