親和蛋白標記探針於活體細胞蛋白標記之應用

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研究生：	林欣慧 LIN, Xin-Hui
論文名稱：	親和蛋白標記探針於活體細胞蛋白標記之應用 Applications of Affinity-Based Protein Labeling Probes in Living Cell Protein Labeling
指導教授：	陳貴通 Tan, Kui-Thong
口試委員:	許馨云 Hsu, Hsin-Yun 黃郁棻 Huang, Yu-Fen
學位類別：	碩士 Master
系所名稱：	理學院 - 化學系 Department of Chemistry
論文出版年：	2019
畢業學年度：	107
語文別：	中文
論文頁數：	93
中文關鍵詞：	親和螢光探針、二氟苯酚辛戊酯、配體導向
外文關鍵詞：	affinity-Based fluorescent probe, esterase, difluorophenyl pivalate
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蛋白質是生物體中很重要的生物分子，利用蛋白質標記的方式，可以幫助我們了解蛋白質在活體細胞中的功能與位置，對疾病的病理研究有莫大幫助。目前，親和螢光探針已經被廣泛地應用於蛋白質標記，其最大的優點在於不需要基因工程，即可標記天然蛋白質。
因此，我們設計了一種新穎的親和螢光探針，藉由二氟苯酚辛戊酯基團的引入，增加對水解酶催化水解的抵抗性，並能有效地、有選擇性地標記細胞裂解液、血清與哺乳動物細胞中的目標蛋白。我們也成功地更換探針上的螢光團或配體，用以優化探針的螢光效果或是標記不一樣的蛋白質，以增加其應用性。
我們相信，這種新穎的探針設計將為基礎蛋白質研究、蛋白質生物成像和醫學診斷提供一個新方法。

Affinity-based fluorescent probe is commonly employed as a method in protein labeling to investigate protein functions and localization in living cells. One of the main advantages of affinity probe is the selective native protein labeling which cannot be accomplished by genetic engineering method.
Herein, we develop a novel affinity-based fluorescent probe strategy which has high stability, good selectivity and sufficient reactivity for protein labeling in living cells. We utilize the difluorophenyl pivalate as the reactive group to resist the catalytic hydrolysis by esterase owing to the moderate pKa of difluorophenol and the large steric hindrance by the pivalate group. In addition, we also showed the modular approach of the probe design by changing the fluorophore and ligand of the probe to label different target proteins in cell lysate, blood serum and living mammalian cell. We believe that the novel probe design will provide a new approach for protein bioimaging and medical diagnosis.

摘要    I
Abstract    II
謝誌    III
第一章 緒論    1
1-1 蛋白質    1
1-2 蛋白質與疾病之關係    2
1-3 蛋白質偵測方法    4
1-3-1 免疫分析法    4
1-3-2 質譜分析法    6
第二章 文獻回顧    8
2-1 螢光蛋白標記    9
2-2 螢光分子標記    11
2-2-1 蛋白質標籤    12
2-2-3 胜肽標籤    15
2-3 親和性蛋白質標記    18
2-3-1 光親和性標記    18
2-3-2 活性蛋白質分析法    19
2-3-3 配體導向蛋白標記    21
第三章 探針設計之概念    24
第四章 結果與討論    26
4-1 探針1-5之測試與討論    26
4-1-1 探針1-5之螢光測試比較    26
4-1-2 被探針2標記後的hCAII活性測試    29
4-1-3 探針2、3之蛋白標記反應實驗    31
4-1-4 探針2、3之選擇性測試    32
4-1-5 探針2與3之專一性測試    35
4-1-6 探針3之標記極限測試    36
4-1-7 探針3之細胞實驗    37
4-2 探針6之設計與測試    38
4-2-1 探針6之合成構想    38
4-2-2 探針6之細胞影像實驗    39
4-3 探針7之設計與測試    42
4-3-1 探針7之選擇性測試    43
4-3-2 探針7之標記極限測試    44
4-3-3 探針7於複雜溶液之蛋白標記測試    45
4-3-4 探針7之細胞實驗    47
4-4 探針8之設計與測試    51
4-4-1 探針8之選擇性測試    52
4-4-2 探針8之蛋白標記反應實驗    53
4-4-3 探針8於複雜環境之蛋白標記    54
第五章 結論    55
第六章 實驗部分    56
6-1 實驗藥品與器材    56
6-2 蛋白質表達與純化    57
6-2-1 蛋白質表達    57
6-2-2 蛋白質純化    59
6-3 聚丙烯醯胺膠體電泳    59
6-3-1 膠片配方    60
6-3-2 膠體電泳實驗    61
6-4 蛋白標記反應實驗    62
6-5 細胞培養及細胞影像實驗    63
6-5-1 培養基及試劑    63
6-5-2 細胞繼代培養    63
6-5-3 細胞影像    64
6-6 西方墨點法    65
第七章 參考資料    67
附錄    72

                                

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