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研究生： 陳培欣
論文名稱： 幾丁聚醣固定蛋白質水解酵素Protease A之研究
The immobilization of protease A on chitosan beads
指導教授： 黃世傑
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 工學院 - 化學工程學系
Department of Chemical Engineering
論文出版年： 2006
畢業學年度： 94
語文別： 中文
論文頁數： 83
中文關鍵詞： 固定化酵素 、蛋白質水解酵素 、幾丁聚醣 、交聯吸附固定法 、交聯劑
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    • 蛋白質水解酵素為所有酵素中使用最廣的一種，可使用於清潔劑產業、啤酒釀造、烘培工業及乳品加工等產業，而利用來自天然生物體的幾丁聚醣固定蛋白水解酵素，可節省生產成本。本研究利用不同乙醯化程度之幾丁聚醣粉末依不同方法製備幾丁聚醣顆粒，進行蛋白水解酵素Protease A之固定，探討製作顆粒的方法(烘乾、濕潤及凍乾)、幾丁聚醣擔體之乙醯化程度(乙醯化程度5％和10％，在本論文裡以DA 5＆DA 10表示) 及固定化方法對固定化之Protease A活性的影響。
    首先，實驗結果發現凍乾的顆粒大小和濕潤的差不多，不過由於凍乾顆粒的表面會形成多孔洞，所以固定的酵素活性最高，其次是濕潤，最差的是烘乾的顆粒。至於在不同乙醯化程度的幾丁聚醣顆粒方面，低的乙醯化程度固定的酵素活性較高。
    再者，以新的交聯吸附固定法來固定酵素，可得到比共價固定法更高的固定量、活性表現和比活性，不過在重複使用性方面則是劣於共價固定法，但若以經濟層面進行考量，交聯吸附固定法應用於酵素固定化具有很大的優勢。
    最後，酵素因為有擔體的保護，所以對於溫度和pH值的變化其穩定度明顯提高，較適反應溫度和pH也變寬。在重複使用性方面，以DA 5的濕潤擔體而言，經共價法固定的酵素可重複使用20次而仍保有70％以上的相對活性。經由計算後得到的酵素動力學參數Km和Vmax，固定化酵素的Km和游離酵素差不多，但是其Vmax則是小於游離酵素。
    關鍵字：固定化酵素，蛋白質水解酵素，幾丁聚醣，交聯吸附固定法，交聯劑

    目錄 摘要 I 目錄 III 一、前言 1 二、文獻回顧 3 2-1 幾丁質與幾丁聚醣 3 2-2 蛋白質水解酵素 6 2-3 酵素之一般性質 8 2-4 酵素固定化 9 2-4-1 固定化介紹 9 2-4-2 選擇擔體材料時需要考慮的條件 10 2-4-3 固定化酵素之性質 12 2-5 幾丁聚醣作為酵素固定的擔體的之優勢 12 2-6固定化的方法 15 2-6-1 擔體結合法 15 2-6-2 交聯法 16 2-6-3 包埋法 16 2-7 交聯劑 21 2-7-1 Genipin的介紹 23 2-8 酵素和酵素間的固定方式 23 2-9 利用固定化增加酵素之穩定性 24 2-10 穩定性的探討 25 三、實驗設備、材料與方法 27 3-1實驗設備 27 3-2實驗材料 27 3-3實驗方法 28 3-3-1 珠粒製作 29 3-3-2 酵素固定方法 29 3-3-2-1 共價固定法 29 3-3-2-2 單純吸附固定法 30 3-3-2-3 交聯吸附固定法 30 3-3-3 幾丁聚醣珠粒上固定 protease A 含量測定 31 3-3-4 活性測定 32 3-3-5 游離和固定化酵素較適pH值與較適溫度之測定 33 3-3-5-1 較適pH值 33 3-3-5-2 較適溫度 33 3-3-6 游離酵素與固定化酵素之穩定性 33 3-3-6-1 熱穩定性 33 3-3-6-2 pH穩定性 34 3-3-7 固定化酵素之重複反應之測定 34 3-3-8 Km及Vmax之測定 34 四、結果與討論 35 4-1 固定於載體上之蛋白質含量計算 35 4-2 Protease A 活性測定 35 4-3 不同乾燥法擔體的表面觀察 35 4-3-1 濕潤珠粒 35 4-3-2 烘乾珠粒 35 4-3-3 凍乾珠粒 36 4-4 Protease A 固定化後的表現與擔體之關係 40 4-4-1 不同乾燥法之珠粒 40 4-4-2 不同乙醯化程度的珠粒 41 4-5 Protease A 固定化後的表現與固定方法之關係 41 4-5-1 以共價方式固定擔體和酵素 42 4-5-2 以吸附方式固定擔體和酵素 42 4-5-3 共價固定和吸附固定的比較 43 4-6 固定後酵素性質討論 55 4-6-1 溫度穩定度 55 4-6-2 較適反應溫度 62 4-6-3 pH值穩定度 65 4-6-4 較適反應pH值 68 4-6-5 固定化酵素重複使用性 70 4-6-6 Km及Vmax之測定 74 4-6-7 優缺點比較 77 五、結論 79 參考文獻 81 表目錄 表2-1 部分甲殼類昆蟲軟體動物以及真菌之幾丁質含量 5 表2-2 選擇擔體材料時需要考慮的條件 11 表2-3 過去曾用幾丁聚醣固定化過的酵素一覽表 14 表2-4 各種固定化方法的優缺點比較 21 表4-1 三種擔體珠粒的物性整理 36 表4-2 常數Km ＆ Vmax (DA 5、濕潤珠粒、共價固定法) 75 表4-3 常數Km ＆ Vmax (DA 5、凍乾珠粒、共價固定法) 76 表4-4 不同乾燥法擔體的優缺點比較 77 表4-5 固定法的優缺點比較整理 78 圖目錄 圖2-1 幾丁質、幾丁聚醣以及纖維素之化學結構 4 圖2-2 幾丁聚醣珠粒的掃瞄電子顯微圖 13 圖2-3 固定方法的分類 18 圖2-4 各種不同的固定化方法 19 圖2-5 orifice method裝置示意圖 20 圖2-6 複合固定化法 20 圖2-7 戊二醛和幾丁聚醣交聯的機制圖 22 圖2-8 EDC和幾丁聚醣交聯的機制圖 22 圖2-9 Genipin和幾丁聚醣交聯機制 23 圖2-10 以酵素胺基固定的機制圖 24 圖3-1實驗流程圖 28 圖3-2 酵素含量標準曲線 32 圖3-3 活性分析標準曲線 33 圖4-1 濕潤幾丁聚醣珠粒的光學顯微鏡圖。 37 圖4-2 烘乾幾丁聚醣珠粒的光學顯微鏡圖 38 圖4-3 凍乾幾丁聚醣珠粒的光學顯微鏡圖 39 圖4-4 共價固定法所固定酵素量的比較（DA 5） 45 圖4-5 共價固定方法所固定protease A活性的比較（DA 5） 45 圖4-6 共價固定法比活性的比較 （DA 5） 46 圖4-7 共價固定法相對比活性的比較 （DA 5） 46 圖4-8 不同乙醯度幾丁聚醣固定protease A 之量（共價固定法之戊二醛法） 47 圖4-9 不同乙醯度幾丁聚醣固定protease A 之量（共價固定法之EDC法） 47 圖4-10 不同乙醯度幾丁聚醣固定protease A 之量（共價固定法之雙官能基法） 48 圖4-11 不同乙醯度幾丁聚醣固定protease A 之量（共價固定法之Genipin法） 48 圖4-12 不同乙醯度幾丁聚醣固定protease A 之活性（共價固定法之戊二醛法） 49 圖4-13 不同乙醯度幾丁聚醣固定protease A 之活性（共價固定法之EDC法） 49 圖4-14 不同乙醯度幾丁聚醣固定protease A 之活性（共價固定法之雙官能基法） 50 圖4-15 不同乙醯度幾丁聚醣固定protease A 之活性（共價固定法之Genipin法） 50 圖4-16 交聯吸附固定法法示意圖 51 圖4-17 戊二醛交聯酵素機制圖(Dequaire et al., 2000) 51 圖4-18 DSP交聯酵素機制圖 52 圖4-19 單純吸附固定法和交聯吸附固定法所固定酵素量的比較（DA 5） 53 圖4-20 單純吸附固定法和交聯吸附固定法所固定protease A之活性比較（DA 5） 53 圖4-21 單純吸附固定法和交聯吸附固定法比活性之比較（DA 5） 54 圖4-22 單純吸附固定法和交聯吸附固定法相對比活性之比較（DA 5） 54 圖4-23 不同乙醯度珠粒之熱穩定度（共價固定法之戊二醛法、濕潤珠粒） 56 圖4-24 不同乙醯度擔體之溫度穩定度的比活性與相對比活性（共價固定法之戊二醛法、濕潤珠粒） 57 圖4-25 不同乾燥法珠粒之熱穩定度（共價固定法之戊二醛法、DA 5） 58 圖4-26 不同乾燥法擔體之溫度穩定度的比活性與相對比活性（共價固定法法之戊二醛法、DA 5） 59 圖4-27 共價固定法之熱穩定度（濕潤擔體、DA 5） 60 圖4-28 共價固定法熱穩定度的比活性與相對比活性（濕潤珠粒、DA 5） 61 圖4-29 不同擔體的反應溫度對相對活性之比較（共價固定之戊二醛法、DA 5） 63 圖4-30 不同擔體的反應溫度比活性與相對比活性之比較（共價固定之戊二醛法、DA 5） 64 圖4-31 共價固定法的反應溫度對相對活性之比較（濕潤擔體、DA 5） 65 圖4-32 不同擔體的pH值穩定度（共價固定之戊二醛法、DA 5） 66 圖4-33 共價固定法pH值穩定度之比較（濕潤珠粒、DA 5） 67 圖4-34 交聯吸附固定法pH值穩定度之比較（濕潤珠粒、DA 5） 67 圖4-35 共價固定法的反應環境pH值對相對活性之比較（濕潤珠粒、DA 5） 69 圖4-36 不同擔體的反應環境pH值對相對活性的影響（共價固定法之戊二醛法、DA 5） 69 圖4-37 交聯吸附固定法反應環境pH值對相對活性的影響（濕潤珠粒、DA 5） 70 圖4-38 以不同擔體固定酵素的回收使用表現圖（共價固定之戊二醛法、DA 5） 72 圖4-39 共價固定法固定酵素的回收使用表現圖（濕潤珠粒、DA 5） 72 圖4-40 交聯吸附固定法固定酵素的回收使用表現圖（濕潤珠粒、DA 5） 73 圖4-41 不同固定化protease A 珠粒之Lineweaver-Burk圖(濕潤珠粒，DA 5) 75 圖4-42 不同固定化protease A 珠粒之Lineweaver-Burk圖(凍乾珠粒，DA 5) 76

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