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研究生: 楊霆礬
Ting-Fan Yang
論文名稱: 具交聯結構之Pluronic®微胞做為藥物制放載體之研究
Crosslinked Pluronic Micelle as a Carrier for Drug Delivery
指導教授: 宋信文
Hsing-Wen Sung
口試委員:
學位類別: 碩士
Master
系所名稱: 工學院 - 化學工程學系
Department of Chemical Engineering
論文出版年: 2005
畢業學年度: 93
語文別: 中文
論文頁數: 68
中文關鍵詞: 藥物制放交聯結構穩定性藥物載體
外文關鍵詞: drug delivery, crosslinked, pluronic, stability, drug carrier
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  •   Pluronic® block copolymers(Pluronic®高分子)為現行藥物制放系統中常被應用的兩性高分子,其在水溶液中可自行排列形成微胞。許多研究以此微胞做為藥物載體來包覆疏水性抗癌藥物,發現其具有抑制癌細胞產生抗藥性的特性。然而當Pluronic®高分子微胞進入人體內的環境,經血液或體液大量稀釋微胞的濃度後,在低於臨界微胞濃度的環境下其結構會開始瓦解,不再能夠有效地保護所包覆藥物。本研究的目的為發展一微胞殼層交聯技術,解決Pluronic®高分子微胞在環境稀釋下產生瓦解的情形。
      實驗以Pluronic® block copolymer L121(L121)為材料,分為三部分來進行。第一部分實驗主要的目的為製備具交聯結構的L121微胞,實驗裡以氧化劑pyridinium chlorochromate(PCC)將L121末端的羥基(-OH)轉換成醛基(-CHO),並利用precipitation/solvent evaporation technique的技術將L121製備成微胞,再以具胺基(-NH2)的化學試劑與其殼層的醛基(-CHO)進行交聯反應。實驗中探討了交聯反應的條件及製備出來的微胞粒徑分佈與表面形態。第二部分實驗探討了材料的生物相容性與交聯前後微胞的穩定性,並以抗癌藥物paclitaxel進行藥物包覆與釋放實驗。第三部分為體外細胞實驗,主要是觀察微胞被口腔上皮癌細胞胞飲的情形,並且探討了微胞包覆paclitaxel後對癌細胞生長抑制的情形。
      第一部分的實驗結果顯示,以1,4-diaminobutane做為交聯架橋,且其上胺基濃度為L121上醛基濃度5倍、交聯反應時間0.5 hr、pH值4.5與室溫為最佳交聯反應條件。交聯後的L121微胞,其粒徑大小約為100 nm。第二部分細胞活性測試(MTT assay)結果顯示,交聯後的L121微胞不會影響L121原先的細胞相容性。微胞穩定性的實驗結果發現,交聯後的L121微胞其穩定性提高了約100倍。藥物釋放結果也顯示交聯後的L121微胞較其交聯前有較緩釋的效果。第三部分體外細胞胞飲實驗結果顯示,交聯後的L121微胞能夠進入癌細胞內。體外抑制癌細胞生長定性與定量的實驗結果,也顯示交聯後的L121微胞能夠控制釋放包覆其內的paclitaxel,且有效地抑制癌細胞生長。
      以上的實驗結果顯示,具交聯結構的L121微胞能提升其做為藥物載體的穩定性,延長藥物在體內循環的時間,並且能夠進入癌細胞內,有效地抑制癌細胞生長。


    內容 頁數 摘要 I 目錄 III 圖索引 VI 表索引 IX 第一章 緒論 1.1 前言 1 1.2 癌症 2 1.3 化學治療 3 1.4 藥物制放(Drug Delivery) 3 1.5 高分子微胞(Polymeric Micelle) 4 1.6 殼層交聯型高分子微胞(Shell-Crosslinked Polymeric Micelle) 5 1.7 Pluronic® block copolymers(PEO-PPO-PEO) 6 1.7.1結構 6 1.7.2命名 7 1.7.3微胞結構 9 1.7.4特性 9 1.8 研究目的與動機 11 第二章 Pluronic®高分子材料改質、微胞製備與交聯技術 之建立 2.1 研究目的 14 2.2 Pluronic® block copolymer L121 14 2.3 L121改質 15 2.4 L121-CHO之醛基定量分析 15 2.5 L121微胞製備 17 2.6 L121微胞表面形態觀察 18 2.7 L121微胞交聯反應條件及交聯程度分析 19 2.7.1三種交聯試劑之交聯程度分析 20 2.7.2交聯劑濃度、交聯反應時間、pH值與溫度 21 2.8 實驗結果與討論 22 2.8.1醛基定量分析 22 2.8.2微胞粒徑與形態分析 23 2.8.3交聯反應條件及交聯程度分析 25 2.9 結論 31 第三章 交聯前後微胞之細胞相容性、穩定性及藥物包覆與釋放行為 3.1 研究目的 33 3.2 細胞相容性 33 3.3 穩定性 36 3.4 藥物包覆與釋放行為 38 3.5 實驗結果與討論 41 3.5.1生物相容性 41 3.5.2穩定性 43 3.5.3藥物包覆與釋放行為 45 3.6 結論 47 第四章 微胞體外(In Vitro)實驗:細胞胞飲與癌細胞生長抑制 4.1 研究目的 49 4.2 體外細胞胞飲(Endocytosis) 49 4.3 體外癌細胞生長抑制(Cell Growth Inhibiton) 52 4.3.1癌細胞生長抑制之活性分析 52 4.3.2免疫染色觀察 53 4.4 實驗結果與討論 54 4.4.1體外細胞胞飲 54 4.4.2體外癌細胞生長抑制 58 4.4.2.1癌細胞生長抑制之活性分析 58 4.4.2.2免疫螢光染色觀察 60 4.5 結論 62 參考文獻 63 圖索引 圖1-1、Enhanced Permeability and Retention(EPR effect) 4 圖1-2、雙性高分子形成微胞示意圖 5 圖1-3、殼層交聯型微胞的結構分為親水性的外殼與疏水性的內核 6 圖1-4、Pluronic® block copolymers包含了兩個親水性的EO鏈段與一個疏水性的PO鏈段 7 圖1-5、Pluronic® block copolymers命名分布圖 8 圖1-6、Pluronic® block copolymers形成微胞示意圖 9 圖1-7、Pluronic® block copolymers對於產生抗藥性的癌細胞(MDR Cancer cell)抑制的機制:(a)降低細胞膜黏度、(b)ATP 消耗、(c, d)藥物流出傳送系統、(e)減小GSH/GST解毒活性、(f)藥物從細胞內酸性液泡中釋放、(g)研究對Apotosis的影響 10 圖1-8、Pluronic®微胞釋放藥物的機制:(A)濃度低於CMC其微胞結構瓦解;(B)利用擴散分離的方式釋放藥物 11 圖1-9、本研究之實驗規劃流程圖 13 圖2-1、Pluronic®高分子改質與交聯 14 圖2-2、Pluronic® block copolymer L121化學結構式 15 圖2-3、左為TBC化學結構式;右為TNBS化學結構式 16 圖2-4、兩種製備微胞的方法:溶解與透析 17 圖2-5、L121微胞製備方法 18 圖2-6、以滴染法方式製作負染色樣品之步驟:(a)滴樣品於膜上,(b)以濾紙吸除液體,(c)滴上染劑,(d)自鑷子夾縫間吸除多餘染劑 19 圖2-7、胺基(-NH2)與磺酸基(-SO3H)的反應 20 圖2-8、各化學試劑之結構式:(a)EDBEA、(b)1,4-diamnobutane、(c)1,2-diaminoethane 21 圖2-9、醛基定量分析檢量線 22 圖2-10、微胞粒徑分布圖:(a)100.3 ± 1.9 nm, PI=0.177、(b)101.4 ± 2.2 nm, PI=0.185 23 圖2-11、穿透式電子顯微鏡(TEM)觀測L121微胞表面形態之結果 24 圖2-12、原子力顯微儀(AFM)觀測L121微胞表面形態之結果 24 圖2-13、醛基定量分析檢量線 25 圖2-14、三種交聯試劑其交聯能力之差異 26 圖2-15、交聯反應時間對交聯程度的影響 27 圖2-16、交聯反應之pH值對交聯程度的影響 28 圖2-17、交聯反應之溫度對交聯程度的影響 29 圖2-18、最佳交聯反應條件 30 圖2-19、交聯後的L121微胞之粒徑大小分布 30 圖2-20、交聯後的L121微胞之表面型態 31 圖3-1、細胞活性測性流程圖(MTT assay) 34 圖3-2、製備含有材料之培養基 35 圖3-3、製備含有交聯材料之培養基 36 圖3-4、L121微胞包覆DPH之製備方法 37 圖3-5、Paclitaxel之化學結構式 38 圖3-6、L121微胞包覆paclitaxel之製備方法 39 圖3-7、體外藥物釋放實驗流程圖 41 圖3-8、材料細胞相容性定性分析 42 圖3-9、材料細胞相容性定量分析 42 圖3-10、交聯前後L121微胞之CMC 43 圖3-11、交聯後的L121微胞穩定性提升之情形 44 圖3-12、藥物包覆之實驗結果 45 圖3-13、微胞包覆藥物後之粒徑分析:(a)125.3 ± 1.7 nm, PI=0.176、(b)689.5 ± 23.9 nm, PI=0.657 46 圖3-14、藥物釋放之實驗結果 47 圖4-1、左:R123化學結構式、右:KB細胞 50 圖4-2、L121微胞包覆R123之製備方法 51 圖4-3、L121微胞細胞胞飲實驗流程圖 52 圖4-4、細胞活性測試流程圖(MTT assay) 53 圖4-5、免疫染色實驗流程圖 54 圖4-6、Free R123被KB細胞胞飲之情形 55 圖4-7、微胞包覆R123被KB細胞胞飲之情形:左為Crosslinked、右為Non-crosslinked 56-57 圖4-8、KB細胞生長抑制培養一天之情形 58 圖4-9、KB細胞生長抑制定量分析之結果(培養一天) 59 圖4-10、KB細胞生長抑制定量分析之結果(培養三天) 59 圖4-11、癌細胞免疫染色之結果:上為Control、下為Free Paclitaxel- 61 圖4-12、癌細胞免疫染色之結果:上為Non-crosslinked、下為Crosslinked 62 表索引 表1-1、台灣地區民國91年主要死亡原因 1 表1-2、Pluronic® block copolymers相關系列高分子之基本資料與性質 7

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