利用參聚離子型siRNA載體在基因沉默上之應用

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研究生：	張唯聖
論文名稱：	利用參聚離子型siRNA載體在基因沉默上之應用 Use of Branched-Poly(ethylenimine) & Poly(2-ethyl-2-oxazoline)-Poly(methacrylic acid)/siRNA Ternary Polyion Complex for Gene Silencing
指導教授：	薛敬和
口試委員:
學位類別：	碩士 Master
系所名稱：	工學院 - 化學工程學系 Department of Chemical Engineering
論文出版年：	2008
畢業學年度：	97
語文別：	中文
論文頁數：	59
中文關鍵詞：	siRNA載體、PEOz 、PMAA 、B-PEI 、siRNA 、細胞毒性、轉染效率、mRNA抑制
外文關鍵詞：	ternary polyion complex, cell viability, transfection, gene silencing
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　　本研究利用多種不同結構之高分子載體，其中具生物相容性及親水性之PEOz 〔poly(2-ethyl-2-oxazoline)〕與具酸鹼應答之PMAA 〔poly(methacrylic acid)〕合成雙團聯共聚物PEOz-b-PMAA〔poly(2-ethyl-2-oxazoline)-block-poly(methacrylic acid) 〕，再進一步藉由電性吸引方式與表面帶正電性之Branched-Poly(ethylenimine)/siRNA (B-PEI/siRNA)前驅物結合，形成具有複合結構的高分子siRNA載體。親水性高分子PEOz裸露於載體外殼，以提高載體於血液循環中之安定性，降低載體本身之細胞毒性，並利用內層B-PEI之高轉染效率來達到改善siRNA傳輸之效率，進而有效抑制基因。
　　本研究首先分析不同重量比B-PEI/siRNA之粒徑大小與界面電位，從中選取粒徑穩定同時表面具正電之前驅物，再與PEOz-b-PMAA藉由靜電吸引形成新型態之複合體。研究結果顯示B-PEI/siRNA前驅物之粒徑約在250~700nm左右，界面電位在20~50 mV，而加入PEOz-PMAA後之複合型微胞粒徑則在250nm以下，且其界面電位則在0∼30mV之間，顯見PEOz可有效遮蔽B-PEI之強正電性。在複合體之細胞毒性測試實驗中，在同樣條件下，PEOz-PMAA/B-PEI複合體相較於單純B-PEI複合體具有較低的細胞毒性，表示複合體可顯著地改善B-PEI/siRNA前驅物之細胞毒性。
　　此外比較各個複合體之轉染效果，實驗結果顯示複合體之轉染效果相較於B-PEI/siRNA雖略幅下降，然而仍具備相當不錯之轉染效率。研究並進一步藉由B-PEI/siRNA前驅物與PEOz-b-PMAA/B-PEI/siRNA複合體抑制冷光蛋白mRNA。實驗結果顯示第24小時其抑制效果最為顯著。
　　整體而言，利用PEOz-PMAA與B-PEI/siRNA所形成之複合體可減低B-PEI/siRNA前驅物之毒性、提高生物相容性；且表現出相當程度的細胞轉染效果，進而表現出優異之mRNA抑制效果。因此為一具有相當潛力之高分子siRNA載體。

摘要    I
Abstract    III
目錄    V
圖目錄    VII
表目錄    IX
   研究動機與背景    1
   相關理論與文獻回顧    4
1.    核酸載體簡介    4
2.    非病毒型核酸載體傳遞的過程    5
2.1.    複合體與細胞表面作用    6
2.2.    內吞作用    6
2.3.    逃離核內體    7
2.4.    siRNA的脫離    8
2.5.    siRNA抑制基因    8
3.    陽離子型高分子核酸載體    10
4.    複合型核酸載體    12
5.    本研究之材料性質與應用    14
5.1    分枝聚乙烯亞胺    14
5.2    聚甲基丙烯酸    14
5.3    Poly(2-ethyl-2-oxazoline)    15
5.4.    siRNA    15
   實驗方法    17
1.    實驗藥品    17
2.    實驗儀器與裝置    18
3.    Poly(2-ethyl-2-oxazoline)之合成    19
4.    聚起始劑(PEOz)2-ABCPA之合成    20
5.    功能性共聚物PEOz-b-PMAA之合成    21
6.    GPC分子量分佈鑑定    22
7.    siRNA之製備    22
8.    B-PEI/siRNA前軀物之製備    24
9.    PEOz –b-PMAA/B-PEI/siRNA雙層結構複合體之製備    24
10.    電泳分析    24
11.    細胞培養與含有luciferase和EGFP表現之重組HT-1080    纖維母細胞之製備    25
12.    複合體之細胞毒性測試    25
13.    轉染複合體之最佳化    26
14.    複合體調控抑制基因表現    27
   結果與討論    28
1.    PEOz之合成與鑑定    28
2.    巨起始劑(PEOz)2-ABCPA之合成與鑑定    30
3.    共聚高分子PEOz-b-PMAA之合成與鑑定    31
4.    以膠體電泳實驗分析微胞穩定性    35
5.    以Branched-PEI 包覆siRNA之粒徑分析與介面電位測試    37
6.    以PEOz-b-PMAA包覆B-PEI/siRNA之粒徑分析與介面電位測試　　　40
7.    含有luciferase和EGFP表現之重組HT-1080纖維母細胞之製備    43
8.    B-PEI/siRNA與PEOz-b-PMAA/B-PEI/siRNA複合體之細胞毒性測試　44
9.    轉染PEOz-b-PMAA/B-PEI/siRNA複合體之最佳化    47
10.    時間相關之抑制Luciferase表現測試    51
11.    siRNA劑量相關之抑制Luciferase表現測試    53
   結論    54
   參考文獻    56

                                

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