第一章前言………………………………………………………………1 第二章 背景介紹…………………………………………………………2 2-1.Michaelis-Menten 方程式…………………………………………2 2-2.酵素的調控機制……………………………………………………7 A. 異位控制 B. 調節蛋白質所造成的刺激與抑制 C. 可逆的共價修飾 D. 蛋白質水解活化 2-3.交互作用……………………………………………………………9 2-4.黃嘌呤氧化酶………………………………………………………10 A. 黃嘌呤氧化酶的結構、催化反應 B. 黃嘌呤氧化酶活性的有無 2-5.黃嘌呤氧化酶相關疾病……………………………………………20 A. 痛風 B. 缺血再灌流傷害 2-6.改變一個原子造成的突變…………………………………………24 2-7.“ 受質抑制 ”作用與 ”受質活化 ”作用……………………26 第三章 實驗原理及方法………………………………………………28 3-1.實驗藥品和儀器……………………………………………………28 A. 實驗藥品 B. 實驗儀器 3-2.XOD的純化原理……………………………………………………31 A. 膠體管柱( size exclusion column ) 分離原理 B. 親和性管柱( affinity column ) 分離原理 C. 除氧原理 D. XOD 純化原理 3-3.純化方法…………………………………………………………36 A. 製備親和性管柱 B. 純化步驟 3-4.黃嘌呤氧化酶濃度與活性的測定………………………………39 A. 黃嘌呤氧化酶濃度的測定 B. 黃嘌呤氧化酶活性的測定-AFR method 3-5.黃嘌呤氧化酶的受質……………………………………………40 A. 受質結構 B. 受質被黃嘌呤氧化酶催化後UV光譜的變化 3-6.推導黃嘌呤氧化酶AA、AI、II form 交互作用的模型………44 A. 黃嘌呤氧化酶之均相二聚體( AA、II form )的模型 B. AA、II form 公式的收斂 C. 黃嘌呤氧化酶之異相二聚體( AI form )的模型 3-7. 以氰化鈉處理的黃嘌呤氧化酶 ( 人造 II form )…………55 A. 氰化黃嘌呤氧化酶的步驟 B. 氰化後的黃嘌呤氧化酶 第四章 實驗結果與討論………………………………………………57 4-1.黃嘌呤氧化酶(AA、II、CN-treated XOD) 光譜的不同………57 A. 黃嘌呤氧化酶AA form 與 氰化後的AA form B. 黃嘌呤氧化酶II form 與 氰化後的AA form 4-2.受質對不同形式的黃嘌呤氧化酶交互作用的影響………………61 A. 均相二聚體 B. 異相二聚體 4-3.Xanthine對不同形式的黃嘌呤氧化酶交互作用的影響…………66 A. AA form B. AI form C. II form D. AA、AI、II form之比較 4-4.Adenine對不同形式的黃嘌呤氧化酶交互作用的影響…………71 A. AA form B. AI form C. II form D. AA、AI、II form之比較 4-5.AHP對不同形式的黃嘌呤氧化酶交互作用的影響………………76 A. AA form B. AI form C. II form D. AA、AI、II form之比較 4-6.Xanthopterin對不同形式的黃嘌呤氧化酶交互作用的影響……81 A. AA form B. AI form C. II form D. AA、AI、II form之比較 4-7.Lumazine對不同形式的黃嘌呤氧化酶交互作用的影響…………87 A. AA form B. AI form C. II form D. AA、AI、II form之比較 4-8. 各種受質對不同形式的黃嘌呤氧化酶交互作用的比較………93 A. 黃嘌呤氧化酶交互作用的程度( AA、II form ) B. 不同形式的黃嘌呤氧化酶針對不同受質的行為之比較 C. 黃嘌呤氧化酶AA form的A form與AI form的A form之不同 第五章 結論……………………………………………………………100 參考文獻………………………………………………………………102 圖目錄 圖2-1.1 Michaelis-Menten 模型……………………………………2 圖2-1.2 Michaelis-Menten模型之酵素催化受質速率………………4 圖2-1.3 酵素動力學中的雙倒數圖形法……………………………..6 圖2-3.1 分子開關與電器開關的相似性……………………………..9 圖2-4.1 (A)黃嘌呤氧化酶的分子結構圖 (B)黃嘌呤氧化酶單體之 各個輔酶的結構圖…………………………………………10 圖2-4.2 黃嘌呤氧化酶催化反應的電子傳遞示意圖………………12 圖2-4.3 黃嘌呤氧化酶催化受質的機制……………………………12 圖2-4.4 除氧下不同狀態的黃嘌呤氧化酶在pH8.5 0.1M磷酸鹽溶液 的UV光譜。…………………………………………………14 圖2-4.5 (A)具活性與不具活性的黃嘌呤氧化酶之差異光譜 (difference spectrum) (B)氰化黃嘌呤氧化酶前後的UV 變化圖譜。…………………………………………………15 圖2-4.6 (A)為不同AFR值的黃嘌呤氧化酶之氰化(CN-)反應，其所 產生的SCN-或ΔA320nm皆與酵素活性成正比 (B)經氰化 處理後的黃嘌呤氧化酶以硫化鈉(Na2S)活化，實心圓點 為正常的Na2S，空心圓點為標定的Na2S。………………15 圖2-4.7 黃嘌呤氧化酶的EPR光譜 (A)AA form (B)氰化後的AA form。………………………………………………………16 圖2-4.8 Native、desulfo、deflavo form黃嘌呤氧化酶之穩定狀 態的螢光光譜。……………………………………………17 圖2-4.9 理論計算三種結構的活性中心在過度狀態時的電子密度分 布[qe/bohr3] (相對於反應物)及鍵長[Å]。……………18 圖2-5.1 AMP降解為尿酸的過程。……………………………………20 圖2-5.2 異位次黃嘌呤(allopurinol) 抑制尿酸生成的方式。…22 圖2-5.3 缺血再灌流傷害的作用機制。……………………………23 圖2-5.4 缺血再灌流傷害的路徑及抑制方法。……………………23 圖2-6.1 彈性蛋白酵素抑制素(anti-elastase)中的methionine氧 化為methionine sulfoxide。……………………………24 圖2-7.1 黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶之Lineweaver-Burk圖。…………26 圖2-7.2 黃嘌呤與黃嘌呤脫氫酶之Lineweaver-Burk圖。…………27 圖3-2.1 親和層析法的作用原理。…………………………………32 圖3-2.2 除氧示意圖。………………………………………………32 圖3-2.3 市售XOD 可能存在的六種形式。…………………………33 圖3-3.1 純化黃嘌呤氧化酶的簡單流程。…………………………38 圖3-4.1 （A）黃嘌呤氧化酶氧化態（—）、氧化態但是無FAD （•••）、還原態（---）之UV光譜 （B）各cofactor由氧 化態變成還原態的UV變化光譜，整體變化(—) 、 Fe/S(-- -)，FAD( )，Mo(•••)。………………………………39 圖3-5.1 嘌呤和喋呤的結構圖。……………………………………40 圖3-5.2 實線為黃嘌呤氧化酶的受質xanthine ( 2,6- dihydroxypurin)虛線為其產物uric acid 。內插圖為產 物扣除起始物的變化圖譜。………………………………41 圖3-5.3 實線為黃嘌呤氧化酶的受質adenine(6-aminopurine)，虛 線為其產物2-hydroxy - 6-aminopurine。內插圖為產物扣 除起始物的變化圖譜。……………………………………41 圖3-5.4 實線為黃嘌呤氧化酶的受質2-amino-4-hydroxypterin， 虛線為其產物isoxanthopterin。內插圖為產物扣除起始 物的變化圖譜。……………………………………………42 圖3-5.5 實線為黃嘌呤氧化酶的受質xanthopterin，虛線為其產物 2-amino-4,6,7- trihydroxypterin。內插圖為產物扣除 起始物的變化圖譜。………………………………………42 圖3-5.6 實線為黃嘌呤氧化酶的受質lumazine，虛線為其產物 2,4,7-trihydroxylpterin。內插圖為產物扣除起始物的 變化圖譜。…………………………………………………43 圖3-6.1 Michaelis-Menten 模型。…………………………………44 圖3-6.2 黃嘌呤氧化酶(AA、II form)催化受質的模型。…………46 圖3-6.3 黃嘌呤氧化酶二聚體與兩個單體。………………………48 圖3-6.4 黃嘌呤氧化酶( AI form ) 催化受質的模型。…………51 圖3-7.1 氰化黃嘌呤氧化酶後的UV光譜。…………………………56 圖4-1.1 氰化對黃嘌呤氧化酶活性中心金屬鉬所造成的改變。…57 圖4-1.2 (A)氰化前和氰化後的黃嘌呤氧化酶UV光譜 (B)氰化前後 的黃嘌呤氧化酶之UV變化圖譜。…………………………58 圖4-1.3 (A)氰化前和氰化後的黃嘌呤氧化酶CD光譜 (B)氰化前後 的黃嘌呤氧化酶之CD變化圖譜。…………………………59 圖4-1.4 (A)黃嘌呤氧化酶AA form、II form氰化後的AAform的 UV光譜 (B)黃嘌呤氧化酶II form和氰化後的AAform的V- [S] 圖。……………………………………………………60 圖4-2.1 動力學實驗所用的受質及結構……………………………64 圖4-3.1 黃嘌呤氧化酶AA form催化xanthine 的 “速率-受質濃 度”圖。……………………………………………………66 圖4-3.2 黃嘌呤氧化酶AI form催化xanthine 的 “速率-受質濃 度”圖。……………………………………………………67 圖4-3.3 黃嘌呤氧化酶II form催化xanthine 的 “速率-受質濃 度”圖。……………………………………………………68 圖4-4.1 黃嘌呤氧化酶AA form催化adenine的“速率-受質濃度” 圖。…………………………………………………………71 圖4-4.2 黃嘌呤氧化酶AI form催化adeninie 的 “速率-受質濃 度”圖。……………………………………………………72 圖4-4.3 黃嘌呤氧化酶II form催化adenine的 “速率-受質濃度” 圖。…………………………………………………………73 圖4-5.1 黃嘌呤氧化酶AA form催化AHP的 “速率-受質濃度” 圖。…………………………………………………………76 圖4-5.2 黃嘌呤氧化酶AI form催化AHP的 “速率-受質濃度” 圖。…………………………………………………………77 圖4-5.3 黃嘌呤氧化酶II form催化AHP的 “速率-受質濃度” 圖。…………………………………………………………78 圖4-6.1 黃嘌呤氧化酶AA form催化xanthopterin的“速率-受質濃 度”圖。……………………………………………………81 圖4-6.2 黃嘌呤氧化酶AI form催化xanthopterin的“速率-受質濃 度”圖。……………………………………………………82 圖4-6.3 黃嘌呤氧化酶II form催化xanthopterin的 “速率-受質 濃度”圖。…………………………………………………83 圖4-7.1 黃嘌呤氧化酶AA form催化lumazine的“速率-受質濃度” 圖。…………………………………………………………87 圖4-7.2 黃嘌呤氧化酶AI form催化lumazine的“速率-受質濃度” 圖。…………………………………………………………88 圖4-7.3 黃嘌呤氧化酶II form催化lumazine的“速率-受質濃度” 圖。…………………………………………………………89 圖4-8.1 黃嘌呤氧化酶( AA、II form ) 針對不同受質交互作用的 程度 (A)催化受質能力方面的影響 (B)結合受質能力方面 的影響。……………………………………………………93 圖4-8.2 黃嘌呤氧化酶針對不同受質的催化速率( k3 ) (A)AA form (B)AI form (C)II form。………………………95 圖4-8.3 黃嘌呤氧化酶針對不同受質的結合能力( Km ) (A)AA form (B)AI form (C)II form。…………………………96 圖4-8.4 黃嘌呤氧化酶二聚體的A form或I form對A form的催化造 成的影響。…………………………………………………97 圖4-8.5 黃嘌呤氧化酶二聚體的A form或I form對A form的結合受 質能力(binding affinity) 造成的影響。………………99 表目錄 表2-4.1 黃嘌呤氧化酶之各輔酶……………………………………11 表2-4.2 Native、desulfo、deflavo form黃嘌呤氧化酶之螢光衰 退(lifetime)參數…………………………………………17 表3-1.1 實驗藥品清單………………………………………………28 表3-2.1 分析黃嘌呤氧化酶純化的過程……………………………35 表3-5.1 受質的最大吸收波長，吸收係數…………………………40 表3-5.2 實驗條件……………………………………………………42 表3-6.1 黃嘌呤氧化酶二聚體與兩個單體的動力學參數轉換……49 表3-7.1 氰化後的黃嘌呤氧化酶的特性……………………………56 表4-2.1 動力學實驗的實驗條件……………………………………65 表4-3.1 黃嘌呤氧化酶AA form、AI form、II form 催化xanthine 的動力學常數………………………………………………69 表4-3.2 黃嘌呤氧化酶催化xanthine的交互作用…………………70 表4-4.1 黃嘌呤氧化酶AA form、AI form、II form 催化adenine 的動力學常數………………………………………………74 表4-4.2 黃嘌呤氧化酶催化adenine的交互作用……………………75 表4-5.1 黃嘌呤氧化酶AA form、AI form、II form 催化AHP的動 力學常數……………………………………………………79 表4-5.2 黃嘌呤氧化酶催化AHP的交互作用…………………………80 表4-6.1 黃嘌呤氧化酶AA form、AI form、II form催化 xanthopterin的動力學常數………………………………84 表4-6.2 黃嘌呤氧化酶催化xanthopterin的交互作用……………85 表4-7.1 黃嘌呤氧化酶AA form、AI form、II form催化lumazine 的動力學常數………………………………………………90 表4-7.2 黃嘌呤氧化酶催化lumazine的交互作用…………………91 表4-8.1 黃嘌呤氧化酶單體間交互作用的程度……………………94