簡易檢索 / 詳目顯示

研究生: 陳慧瑜
Chen, Huei-Yu
論文名稱: 發展一神經軸突收集裝置
Development of an axon-producing device
指導教授: 張兗君
Chang, Yen-Chung
口試委員: 周韻家
傅建中
學位類別: 碩士
Master
系所名稱: 生命科學暨醫學院 - 分子醫學研究所
Institute of Molecular Medicine
論文出版年: 2011
畢業學年度: 99
語文別: 中文
論文頁數: 47
中文關鍵詞: 海馬迴神經細胞.軸突
相關次數: 點閱:3下載:0
分享至:
查詢本校圖書館目錄 查詢臺灣博碩士論文知識加值系統 勘誤回報
  • 神經元 (neuron) 是一種高度特化細胞,具許多特化性次細胞結
    構。分離純化次細胞結構進行蛋白質分析方面一直是科學家們有興趣
    研究的課題。軸突是神經細胞中最長的神經纖維,主要功能為由細胞
    本體與軸突尾端間傳遞動作電位、訊號及物質。就目前文獻中並無好
    的工具方法能夠收集大量且單純的神經軸突蛋白質,因此我們發展一
    套神經軸突收集裝置,此裝置可使神經元之細胞本體、樹突與軸突分
    隔在兩個特定不同的環境,進而大量純化軸突。裝置包括上層由PCTE
    (聚碳酸酯)孔徑為3 μm 的多孔細胞濾膜,和下層為具有孔洞且厚
    度為300 μm 或500 μm 的PDMS 層組成。在上層PCTE 多孔細胞濾
    膜表面生長的神經細胞的軸突與樹突可穿過細胞濾膜生長至下層具
    有孔洞的PDMS 層洞孔中。樹突之平均長度較軸突短,一般僅有軸
    突能長得夠長到達PDMS層之背面。本實驗目的想要測試厚度300 μm
    或500 μm 的PDMS 層之背面是否能收集單純軸突。以此運用laminin
    和collagen 之濃度梯度,引導海馬迴神經細胞之軸突往PDMS 層生
    長。此裝置與最近本實驗室所發展一套神經細胞培養基板裝置目的相
    同,透過此設計預期將可收集至20~30 倍的軸突產量,未來收集之軸
    突將足以進行次細胞胞器及其結構之分離、研究、分析。


    中文摘要 ..................................................................................................... i 目錄 ............................................................................................................ ii 壹、緒論 ..................................................................................................... 1 貳、實驗材料與方法 ................................................................................ 5 一、實驗材料 .................................................................................... 5 (一)老鼠的育種 .......................................................................... 5 (二) 細胞培養(Cell culture) ................................................. 5 (三) 裝置模板的製作 ................................................................ 6 (四) 免疫螢光染色法 (Fluorescence immunostaining) ........... 6 二、實驗方法 .................................................................................... 7 (一)實驗步驟 .............................................................................. 7 (二) 多孔細胞濾膜選擇 ............................................................ 8 (三)PDMS 上層/下層平面模板的製作拔除與清洗 ................ 8 (四) 具厚度且孔洞的PDMS 層之模仁(mold)製作:............... 8 (五)製作具厚度且孔洞的PDMS 層之模板與清洗............... 10 (六)裝置液體隔離(Fluidic isolation)效能測試 ....................... 10 (七) 大鼠解剖(Dissection) ...................................................... 11 (八)神經細胞的培養 ................................................................ 11 (九)利用免疫螢光染色法觀察神經細胞的生長情況 ........... 12 (十) 神經細胞次單位結構樣本蛋白的收集 ......................... 13 (十一)凝膠電泳分析(SDS-PAGE) .......................................... 14 (十二)銀染色法 (Silver staining) ............................................ 15 (十三)統計方法及分析 ............................................................ 16 参、結果 ................................................................................................... 17 一、神經軸突收集裝置之設計 ...................................................... 17 (一)裝置之主要組件介紹: .................................................... 17 (二) 裝置原理介紹: ............................................................ 17 二、神經軸突收集裝置之研究 ...................................................... 18 (一) 具有厚度且孔洞的PDMS 層之製作 ............................. 18 (二) 裝置液體隔離(Fluidic isolation)效能測試 ..................... 19 (三) 神經細胞培養之條件 ...................................................... 19 (四)以神經軸突裝置區隔細胞次單位結構之生長 ............... 20 (五) 分離次細胞結構蛋白質分析比較.................................. 22 肆、討論 ................................................................................................... 25 一、神經軸突收集裝置之設計 ...................................................... 25 二、 在製作具厚度且孔洞的PDMS 層之方面 ........................... 25 三、神經細胞培養之條件 .............................................................. 26 四、神經軸突的蛋白質產率與分佈分析 ...................................... 27 五、未來的展望 .............................................................................. 28 伍、圖集 ................................................................................................... 29 圖二、神經軸突收集裝置之概要示意圖 ...................................... 30 圖三、多孔細胞濾膜層與具厚度且孔洞的PDMS 層之設計概念........................................................................................................... 31 圖四、具厚度且孔洞的PDMS 層製作 ......................................... 32 圖五、神經軸突收集裝置之液體隔離效能測試 .......................... 33 圖六、利用神經軸突裝置進行神經細胞之培養條件 .................. 34 圖七、利用免疫螢光染色法觀察神經細胞(DIV17)於多孔細胞濾 膜上下方之生長情形 ...................................................................... 36 圖八、觀察神經細胞(DIV17)於厚度500μm 且具孔洞PDMS 層背 面之生長情形 .................................................................................. 37 圖九、利用免疫螢光染色法觀察神經細胞(DIV17)比較不同厚度 具孔洞的PDMS 層背面之生長情形 ............................................. 38 圖十、神經軸突收集裝置之軸突蛋白產率分析 .......................... 40 圖十一、兩種不同裝置所得的細胞次單位結構樣本蛋白分析 .. 42 陸、參考文獻........................................................................................... 43 柒、附錄 ................................................................................................... 47

    Chen , Z.L., Yu, W.M., Stricklan, S. (2007) Ann. Rev. Neurosci. 30,
    209-33.ox L. J., Hengst U., Gurksaya N. G., Lukyanov K. A. and
    Jaffrey S. R. (2008) Intra-axonal translation and retrograde
    trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol.
    10:149-59.
    Chotard, C. and I. Salecker (2004). "Neurons and glia: team players in
    axon guidance." Trends in Neurosciences 27(11): 655-661.
    Clark, P.,Britland,s.,Connolly,P.(1993). Growth cone guidance and neuron
    morphology on micropatterned laminin surfaces. Jcell Sci 105:
    203-212
    Daniloff, J.K., Levi, G., Grumet, M., Rieger, F., and Edelman, G.M. (1986).
    Alteredexpression of neuronal cell adhesion molecules induced by
    nerve injury and repair. J Cell Biol 103, 929-945.
    Goedert M., Crowther R. A. and Garner C. C. (1991)Molecular
    characterization of microtubule-associated proteins tau and MAP2.
    Trends Neurosci. 14:193-9.
    Hanz S, Perlson E, Willis D, Zheng JQ, Massarwa R, Huerta JJ,
    Koltzenburg M, Kohler M, van-Minnen J, Twiss JL,
    FainzilberM(2003)Axoplasmic importins enable retrograde injury
    signaling in lesioned nerve.Neuron 40:1095–1104.
    Hammarback, J. A., J. B. McCarthy, et al. (1988). "Growth cone guidance
    by substrate-bound laminin pathways is correlated with neuron
    to pathway adhesivity." Developmental Biology 126(1): 29-39.
    Hengst U., Deglincerti A., Kim H. J., Jeon N. L. and Jaffrey S. R. (2009)
    Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation
    of a polarity complex protein. Nat Cell Biol. 11(8):1024-30.
    Millet, L. J., M. E. Stewart, et al. (2010). "Guiding neuron development
    with planar surface gradients of substrate cues deposited using
    microfluidic devices." Lab on a Chip 10(12): 1525.
    Poon, M. M., S. H. Choi, et al. (2006). "Identification of Process-Localized
    mRNAs from Cultured Rodent Hippocampal Neurons." Journal of
    Neuroscience 26(51): 13390-13399.
    Schmidt,C.E.,J.D.A.Lauffenburger,M.P.Sheetz,and A.F.Horwitz.1995.
    Integrin-cytoskeletal interations in neuronal growth cones. Journal of
    Neuroscience 15(5Pt):3400-3407
    Song, A, H., Wang, D., Chen, G., Li, Y., Luo, J, Duan, S., Poo, M.M. (2009)
    Cell 136, 1148-1180.
    Tai,H.C.,Buettner,H.M.(1998) Neurite outgrowth and growth cone
    morphology on micropatterned surfaces.Biotechnology Progress
    14(3):364-370
    Taylor, A. M., M. Blurton-Jones, et al. (2005). "A microfluidic culture
    platform for CNS axonal injury, regeneration and transport."
    Nature Methods 2(8): 599-605.
    Turney,S.G,and P.C.Bridgman.2005.Laminin stimulates and guides axonal
    outgrowth via growth cone myosin Ⅱactivity.Neurosci 8
    (6):717-719
    Ulfig N., Nickel J. and Bohl J. (1998) Monoclonal antibodies SMI 311 and
    SMI 312 as tools to investigate the maturation of nerve cells and
    axonal patterns in human fetal brain. Cell Tissue Res. 291:433-443.
    Verma P, Chierzi S, Codd AM, Campbell DS, Meyer RL, Holt CE, Fawcett
    JW (2005) Axonal protein synthesis and degradation are necessary
    for efficient growth cone regeneration. J. Neurosci. 25:331–342.
    Wu, H.-I., G.-H. Cheng, et al. (2010). "A lab-on-a-chip platform for
    studying the subcellular functional proteome of neuronal axons."
    Lab on a Chip 10(5): 647.
    Xia Y. and Whitesides G. M. (1998) Soft Lithography. Angew. Chem. Int.
    Ed., 37: 550-75.
    Yao J., Sasaki Y., Wen Z., Bassell G. J. and Zheng J. Q. (2006) An essential
    role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent
    growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9:1265-73.
    Zheng JQ, Kelly TK, Chang B, Ryazantsev S, Rajasekaran AK, Martin
    KC, Twiss JL (2001) A functional role for intra-axonal protein
    synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J.
    Neurosci. 21:9291–9303.

    無法下載圖示 全文公開日期 本全文未授權公開 (校內網路)
    全文公開日期 本全文未授權公開 (校外網路)
    全文公開日期 本全文未授權公開 (國家圖書館:臺灣博碩士論文系統)
    QR CODE