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研究生: 廖振剛
論文名稱: 含有胚胎幹細胞分化之心肌細胞片生物組織工程支架: 體外性質評估
指導教授: 宋信文
口試委員:
學位類別: 碩士
Master
系所名稱: 工學院 - 化學工程學系
Department of Chemical Engineering
論文出版年: 2008
畢業學年度: 96
語文別: 中文
論文頁數: 42
中文關鍵詞: 胚胎幹細胞
外文關鍵詞: ES cell
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  • 心肌梗塞為冠狀動脈硬化,導致心肌組織產生缺氧壞死。臨床上可以利用人工補綴片來修補壞損的心肌組織 ,以恢復心臟的部分功能。本篇研究利用甲基纖維素培養系統,製作出心肌細胞片並嵌入多孔性細胞支架中,體外培養成新穎性組織工程細胞支架。在實驗的一開始,利用甲基纖維素培養系統,成功製作出不貼附於培養皿的胚胎體。並加入適量濃度的維他命C (10-2mol/l) ,並以流式細胞儀分析,在加入維他命C誘導的條件下,分化第8 天後大約有15 % 左右的細胞帶有著心肌細胞的特有蛋白 myosin heavy chain (MHC)。在成功分化出心肌細胞後,利用甲基纖維素溫度敏感性的特性得到具有跳動性質的細胞片,並將細胞片置入製備好的多孔性牛心包膜細胞支架的切口中,進行體外培養,探討細胞在其內增生、分化的情形。製作出三明治細胞支架後,為了驗證可行性,藉由切片染色H&E 觀察細胞是否成功坐落於心包膜切口中。接著更近一步運用免疫螢光染色,對坐落於心包膜中的細胞和細胞片進行心肌細胞特有蛋白( myosin heavy chain,connexin 43,α-actinin) 辨認,証實置入進心包膜的細胞確實包含著心肌細胞。接著,藉由免疫螢光染色觀察,在細胞片中細胞支架孔洞裡有新生的細胞外間質蛋白(fibronectin,collagen I,collagen III),證實了直接植入細胞片的方法有利於細胞在牛心包膜中環境生長。然而,在實驗的進行中。藉由免疫染色觀察到細胞支架內有著血管組織的產生,顯示著胚胎幹細胞在分化時,不只是分化成心肌細胞於細胞支架內,同時也分化出提供心肌細胞養分的血管產生。以上結果顯示以胚胎幹細胞製作組織工程細胞支架是具有可行性的。


    摘要 II 目錄 III 圖索引 V 第一章 緒論 1.1 組織工程 1 1.2 心肌梗塞及傳統治療 2 1.3 胚胎幹細胞 2 1.4 誘導胚胎幹細胞分化心肌細胞-----------------------------------------3 1.5 甲基纖維素 4 1.6 細胞外間質 5 1.7 細胞片組織工程-----------------------------------------------------------5 1.8 研究動機與目的-----------------------------------------------------------7 1.9 實驗規劃--------------------------------------------------------------------9 第二章 實驗材料與方法 2.1 研究目的 10 2.2 實驗材料與方法 10 2.2.1胚胎幹細胞體外培養 10 2.2.2甲基纖維素的製備 11 2.2.3利用甲基纖維素製作胚胎體分化成心肌細胞 11 2.2.4製作心肌細胞片 12 2.2.5去細胞牛心包膜製備 13 2.2.6牛心包膜切口處理----------------------------------------------14 2.2.7牛心包膜的機械性質測試 16 2.2.8細分化比例計算(流式細胞儀) 17 2.2.9免疫螢光染色 18 第三章 胚胎幹細胞培養以及細胞片製作 3.1 研究目的 19 3.2胚胎幹細胞體外培養 19 3.3胚胎幹細胞體製造胚胎體 20 3.4胚胎體的形成 20 3.5胚胎體回貼能力測試 22 3.6維他命C誘導胚胎幹細胞分化成心肌細胞 23 3.7胚胎幹細胞分化成心肌細胞的比例計算 24 3.8心肌細胞體外培養 26 3.9 利用水膠系統製造細胞片 27 3.10結論 30 第四章 製作含有胚胎幹細胞分化之心肌細胞片之生物組織工程 支架 4.1 研究目的 31 4.2細胞支架的製備 31 4.3細胞支架機械強度測試 32 4.4三明治細胞支架體內培養的探討 33 4.4.1免疫染色切片 33 4.4.2細胞支架中細胞存活性的探討 34 4.4.3免疫螢光標定螢光細胞 35 4.4.4免疫螢光染色觀察細胞外間質 37 4.4.5血管新生於細胞支架 39 4.5結論 40 圖索引 圖1-1、老鼠胚胎幹細胞分化生長流程圖 3 圖1-2、甲基纖維素的高分子結構 4 圖1-3、細胞片組織工程示意圖 6 圖2-1、利用甲基纖維素製作胚胎體流程 11 圖2-2、利用甲基纖維素製做心肌細胞片流程 12 圖2-3、牛心包膜製作流程圖 14 圖2-4、心包膜酒精梯度滅菌流程圖 15 圖2-5、製備包含細胞片的三明治補綴片 15 圖2-6、機械性質測試示意圖 16 圖2-7、流式細胞儀細胞染色流程圖 17 圖2-8、免疫螢光染色流程圖 18 圖3-1、胚胎幹細胞在培養皿上生長型態 20 圖3-2、在甲基纖維素塗布的培養皿上製作胚胎體 21 圖3-3、胚胎體回貼培養皿分化成心肌細胞 22 圖3-4、加入維他命C 對於胚胎幹細胞分化的影響 23 圖3-5、流式細胞儀分析心肌蛋白比例 25 圖3-6、胚胎體分化成心肌的圖形 26 圖3-7、胚胎幹細胞分化成心肌細胞的特有蛋白表現 27 圖3-8、胚胎體貼附於甲基纖維素塗佈膠原蛋白的情形 28 圖3-9、細胞片跳動之情形 29 圖4-1、牛心包膜巨觀以及微觀圖形 31 圖4-2、細胞支架拉力測試 32 圖4-3、三明治細胞支架體外培養 33 圖4-4、細胞於細胞支架內凋亡情形 34 圖4-5、免疫螢光染色標定心肌蛋白 36 圖4-6、Masson & Trichrome 免疫染色切片圖 37 圖4-7、螢光染色標定fibronectin、collagen III、collagen I蛋白 38 圖4-8、免疫螢光染色平滑肌和內皮細胞 39

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