奈米碳球表面官能基團對細胞毒性影響之探討

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研究生：	蔡馨慧 Tsai, Hsin-Hui
論文名稱：	奈米碳球表面官能基團對細胞毒性影響之探討 The effects of different surface functionalized carbon nanoparticles on cytotoxicity
指導教授：	黃國柱 Hwang, Kuo-Chu
口試委員:
學位類別：	碩士 Master
系所名稱：	理學院 - 化學系 Department of Chemistry
論文出版年：	2010
畢業學年度：	98
語文別：	中文
論文頁數：	73
中文關鍵詞：	奈米碳球、表面官能基團、細胞毒性
外文關鍵詞：	iron/carbon nanoparticle, surface functional group, cytotoxicity
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摘要
本文使用固態微波電弧法製備具有殼－核結構之石墨層－金屬鐵的磁性奈米碳球 (Fe@CNPs) ，尺寸為4~30 nm，並於石墨表面修飾上各種具有不同物理化學特性的高分子官能基團，並利用FTIR、TGA鑑定Fe@CNPs表面接上的官能基結構及數量，同時量測不同溶液中碳球的zeta potential來確認個別官能基化後其表面的有效電荷，並且探討這些奈米碳球在具有相同尺寸、材料化學組成的情況下，不同表面特性對於細胞毒性的效應。
在MTT細胞毒性測試實驗當中，採用HeLa細胞株並在兩種培養液條件中，利用MTT assay、AnnexinV-PE & 7-AAD螢光雙染法偵測細胞凋亡以及DCFH-DA偵測reactive oxygen species (ROS) 的產生來探討奈米碳球的表面特性對於細胞毒性的效應以及可能死亡途徑。在各項結果中我們發現不同培養液會改變奈米碳球的表面電荷，而表面為正電荷的奈米碳球對於HeLa cell有較顯著的細胞毒性，其中針對TMAEA、Imi.與AA修飾的碳球所做進一步細胞凋亡的偵測中，在1小時培養條件中發現這三種奈米碳球的刺激會使得細胞膜的通透性增加，尤其以Fe@CNP-Imi.引發的程度最為明顯；而48小時內引起的細胞凋亡比例以無血清條件下的Fe@CNP-TMAEA和Fe@CNP-Imi.較高，而這與MTT所得的毒性結果和細胞凋亡有高度關聯性。另外細胞內活性氧分子的偵測結果中，含血清培養液中血清蛋白本身具有抗氧化特性，這亦是造成碳球毒性較低的可能因素；在無血清培養液中，正電荷的Fe@CNP-Imi.引發細胞內大量ROS累積，並且在抗氧化劑N-acetyl cystein的情況下，可發現其對ROS的抑制使Fe@CNP-Imi.的細胞毒性大幅降低，顯示Fe@CNP-Imi.導致細胞死亡與其引發細胞內大量ROS的產生有高度相關，而Fe@CNP-TMAEA和Fe@CNP-AA引起的ROS比例則減少許多，與其細胞毒性關聯性較小。
而在Fe@CNP-Imi.和Fe@CNP-TMAEA做為基因轉染載體的應用當中，Fe@CNP-Imi.整體轉染效率明顯高於Fe@CNP-TMAEA，而DNA與Fe@CNP-Imi.的結合力較高且較強導致其可攜帶的DNA量較多為主要可能原因；另外持續提高DNA的混合比例時，反而使Fe@CNP-Imi.基因轉染效率降低，經由DNA結合量與表面電荷的測量與細胞凋亡比例的偵測，表面負電荷減少細胞攝取同時降低了細胞毒性，但也進而造成基因轉染效率下降為其中可能的原因。

目錄
摘要.................................................................................................................................I
目錄..............................................................................................................................III
圖目錄..........................................................................................................................VI
表目錄..........................................................................................................................IX




第一章 緒論..................................................................................................................1
1-1 前言.........................................................................................................................1
1-2 研究動機.................................................................................................................1
1-3 文獻回顧.................................................................................................................2
1-3.1 奈米碳球簡介......................................................................................................2
1-3.2奈米材料對生物生理上之影響...........................................................................3
1-3.3 基因轉染..............................................................................................................5
1-4 儀器及相關原理.....................................................................................................7
1-4.1 人類子宮頸癌細胞 (HeLa cell) 簡介...............................................................7
1-4.2 pAcGFP1-C1 Vector介紹....................................................................................7
1-4.3 MTT細胞毒性測試..............................................................................................8
1-4.4 凋亡細胞的識別..................................................................................................9
1-4.5細胞內reactive oxygen species (ROS) 的偵測.................................................12
1-4.6 DNA電泳...........................................................................................................13
1-4.7 zeta potential原理...............................................................................................14
1-4.8 流式細胞儀........................................................................................................15

第二章 實驗藥品與儀器設備...................................................................................17
2-1 化學合成實驗藥品..............................................................................................17
2-2 化學實驗設備......................................................................................................19
2-3 細胞培養＆生物實驗藥品..................................................................................19
2-4 細胞培養＆生物實驗儀器設備..........................................................................21

第三章 實驗方法及步驟...........................................................................................22
3-1 官能基化奈米碳球之合成..................................................................................22
3-1.1 製備包覆鐵之奈米碳球 (Fe@CNPs) .............................................................22
3-1.2 奈米碳球 (Fe@CNPs) 表面官能基化............................................................22
3-1.3 在已官能基化之Fe@CNP-2-vinylpyrazine上進行甲基化............................24
3-1.4 將Fe@CNP-2-hydroxyethyl acrylate表面之-OH group取代為1-methyl imidazole及trimethylphosphite...................................................................................24
3-2 不同表面官能基團之Fe@CNPs (Fe@CNP-F.G.) 對HeLa cell之細胞毒性探討..................................................................................................................................25
3-2.1 zeta potential之測量...........................................................................................25
3-2.2 細胞繼代與培養................................................................................................26
3-2.3 細胞計數............................................................................................................26
3-2.4 MTT assay－不同表面官能基團之Fe@CNPs (Fe@CNP-F.G.) 的細胞毒性測試..................................................................................................................................27
3-2.5 細胞凋亡偵測－Annexin V-PE ＆ 7-AAD螢光雙染法................................28
3-2.6細胞內reactive oxygen species (ROS) 的偵測.................................................28
3-2.7 Anti-oxidant N-acetyl aystein (Nac) 對細胞的預處理.....................................28
3-3 Fe@CNP-polycation在基因轉染上的應用.........................................................29
3-3.1 DNA分別與Fe@CNP-Imi. 和Fe@CNP-TMAEA Cpx.的配製......................29
3-3.2 以瓊酯糖凝膠電泳測試Fe@CNP-polycation與DNA的結合能力...............29
3-3.3 以流式細胞儀測定Fe@CNP-Imi. 和Fe@CNP-TMAEA攜帶pAcGFP在HeLa cell中的表達量..................................................................................................29
3-3.4 不同混合比例之DNA/Fe@CNP-Imi. Cpx.引發細胞凋亡比例之偵測.........30

第四章 結果與討論....................................................................................................31
4-1 材料鑑定與結果...................................................................................................31
4-1.1 鑑定Fe@CNPs結構..........................................................................................31
4-1.2 鑑定Fe@CNPs表面官能基團結構及數量......................................................34
4-2 表面修飾不同官能基團之Fe@CNPs對HeLa cell的細胞毒性測試................47
4-2.1 各種Fe@CNP-F.G.之MTT細胞毒性測試.......................................................47
4-2.2 PE-Annexin V ＆ 7-AAD螢光雙染法偵測細胞死亡途徑.............................50
4-2.3細胞內reactive oxygen species (ROS) 的偵測.................................................52
4-3 Fe@CNP-polycation在基因轉染上的應用.........................................................62
4-3.1 利用瓊酯糖凝膠電泳測定Fe@CNP-polycation與DNA的結合能力...........62
4-3.2 以流式細胞儀測量pGFP在HeLa cell中的表現量.........................................62
4-3.3 影響不同比例DNA/Fe@CNP-Imi.的基因轉染效率因素探討......................63

第五章 結論................................................................................................................69

參考文獻......................................................................................................................71






圖目錄
圖1-1 中空以及填充金屬的奈米碳球........................................................................3
圖1-2 粒子粒徑與表面分子所佔百分比間的關係....................................................3
圖1-3 pAcGFP1-C1的多重選殖位 (multiple cloning site，MCS) 及限制圖譜........8
圖1-4 MTT被粒線體中的酵素還原為formazan的機制............................................9
圖1-5 Annexin V與外翻之磷脂醯絲胺酸結合而達成螢光標記示意圖.................10
圖1-6 zeta potential定義示意圖.................................................................................14
圖3-1 包覆鐵之奈米碳球 (Fe@CNPs) 形成機制簡單示意圖..............................22
圖3-2 利用微波及超音波震盪將高分子修飾於Fe@CNPs表面之示意圖............23
圖3-3 已修飾2-vinylpyrazine之Fe@CNPs進行官能基團的甲基化......................24
圖3-4 Fe@CNP-HEA之-OH取代為1-methyl imidazole及trimethylphosphite.......25
圖3-5 血球計數盤，計數時以角落四個大方格內的細胞為主................................26
圖4-1 利用微波電弧法合成之Fe@CNPs的TEM影像...........................................32
圖4-2 利用微波電弧法合成之Fe@CNPs的HRTEM影像.....................................32
圖4-3 Fe@CNPs的XRD光譜....................................................................................33
圖4-4 Fe@CNPs的Raman光譜.................................................................................33
圖4-5 Fe@CNP-TMAEA的IR光譜...........................................................................38
圖4-6 Fe@CNP-TMAEA的熱重損失分析圖譜........................................................38
圖4-7 Fe@CNP-VP的IR光譜....................................................................................39
圖4-8 Fe@CNP-VP的熱重損失分析圖譜.................................................................39
圖4-9 Fe@CNP-PPh3的IR光譜.................................................................................40
圖4-10 Fe@CNP-PPh3的熱重損失分析圖譜............................................................40
圖4-11 Fe@CNP-TAZC的IR光譜.............................................................................41
圖4-12 Fe@CNP-TAZC的熱重損失分析圖譜..........................................................41
圖4-13 Fe@CNP-VPraMe的IR光譜.........................................................................42
圖4-14 Fe@CNP-VPraMe的熱重損失分析圖譜......................................................42
圖4-15 Fe@CNP-HEA的IR光譜...............................................................................43
圖4-16 Fe@CNP-HEA的熱重損失分析圖譜............................................................43
圖4-17 Fe@CNP-Imi.的IR光譜.................................................................................44
圖4-18 Fe@CNP-Imi.的熱重分析圖譜......................................................................44
圖4-19 Fe@CNP-P(OMe)3的IR光譜.........................................................................45
圖4-20 Fe@CNP-P(OMe)3的熱重損失分析圖譜......................................................45
圖4-21 Fe@CNP-AA的IR光譜.................................................................................46
圖4-22 Fe@CNP-AA的熱重損失分析圖譜..............................................................46
圖4-23 細胞分別在含血清及無血清培養液中的增殖速率 (n=3).........................53
圖4-24 表面不同官能基化之奈米碳球在不同培養液中的zeta potential (n=3)....53
圖4-25 以MTT assay測試表面不同官能基化之奈米碳球在含血清培養液中的細胞毒性 (n=3).................................................................................................54
圖4-26 以MTT assay測試表面不同官能基化之奈米碳球在不含血清培養液中的細胞毒性 (n=3).............................................................................................54
圖4-27 以Annexin V-PE & 7-AAD偵測Fe@CNP-TMAEA，Fe@CNP-Imi.，Fe@CNP-AA刺激後1小時HeLa cell的凋亡情形.....................................55
圖4-28 比較不同培養液中Fe@CNP-TMAEA，Fe@CNP-Imi.，Fe@CNP-AA刺激後1小時對7-AAD具通透性的細胞比例 (n=3).....................................56
圖4-29 以Annexin V-PE & 7-AAD偵測Fe@CNP-TMAEA，Fe@CNP-Imi.，Fe@CNP-AA刺激後48小時HeLa cell的凋亡情形...................................57
圖4-30 比較不同培養液中Fe@CNP-TMAEA，Fe@CNP-Imi.，Fe@CNP-AA刺激後48小時的凋亡細胞比例 (n=3)............................................................58
圖4-31 比較含血清培養液中以MTT assay和Annexin V-PE & 7-AAD螢光雙染法所測得之細胞存活率 (n=3).....................................................................59
圖4-32 比較不含血清培養液中以MTT assay和Annexin V-PE & 7-AAD螢光雙染法所測得之細胞存活率 (n=3).................................................................59
圖4-33 以DCFH-DA偵測Fe@CNP-TMAEA，Fe@CNP-Imi.，Fe@CNP-AA刺激後48小時HeLa cell中的產生ROS的情形.............................................60
圖4-34 Fe@CNP-TMAEA，Fe@CNP-Imi.，Fe@CNP-AA刺激下HeLa cell於無血清培養液中以及分別在有和無Nac存在下48小時的細胞存活率 (n=3)...............................................................................................................61
圖4-35 以瓊酯糖凝膠電泳測試各種Fe@CNP-F.G.與pAcGFP的結合能力.........64
圖4-36 不同重量比之DNA/Fe@CNP-Imi. 和DNA/Fe@CNP-TMAEA Cpx.對於HeLa cell的基因轉染效率之個別FL1 histogram。(a)pAcGFP only；(b)lipofectamine；(c)DNA/Fe@CNP-Imi.=0.02，(d)0.04，(e)0.06，(f)0.08；(g)DNA/Fe@CNP-TMAEA=0.02，(h)0.04，(i)0.06，(j)0.08..........................65
圖4-37 不同重量比之DNA/Fe@CNP-Imi.及DNA/Fe@CNP-TMAEA對於HeLa cell的基因轉染效率統計比較圖 (n=3)。[*For Fe@CNP-TMAEA，n=1。].......66
圖4-38 不同重量比之DNA/FeCNP-Imi. Cpx.中的DNA結合量...........................66
圖4-39 不同重量比之DNA/Fe@CNP-Imi. Cpx.在pH=7.0下測得的zeta       potential (n=3) ...............................................................................................66
圖4-40 以Annexin V-PE & 7-AAD偵測不同重量比之DNA/Fe@CNP-Imi. Cpx. 餵入HeLa cell後細胞凋亡情況...................................................................67
圖4-41 不同重量比之DNA/Fe@CNP-Imi. Cpx.引起細胞凋亡比例統計圖(n=3) ..............................................................................................................68







表目錄
表1-1 凋亡和壞死細胞生化特徵及型態上的差異比較..........................................11
表1-2 Annexin V和7-AAD (或PI) 染色後所指示的細胞狀態...............................11
表1-3 常用來標記蛋白質之螢光物質......................................................................12
表1-4 常用來標記DNA之螢光物質........................................................................12
表1-5 不同agarose濃度所適宜解析的DNA大小範圍...........................................13
表1-6 不同acrylamide濃度所適宜解析的DNA大小範圍.....................................14
表3-1 各種單體與Fe@CNPs進行聚合反應的實驗條件........................................24
表4-1 含血清培養液中Fe@CNP-TMAEA，Fe@CNP-Imi.，Fe@CNP-AA刺激後1小時之各細胞狀態比例 (n=3) .................................................................56
表4-2 不含血清培養液中Fe@CNP-TMAEA，Fe@CNP-Imi.，Fe@CNP-AA刺激後1小時之各細胞狀態比例 (n=3) .............................................................56
表4-3 含血清培養液中Fe@CNP-TMAEA，Fe@CNP-Imi.，Fe@CNP-AA刺激後48小時之各細胞狀態比例 (n=3) ...............................................................58
表4-4 不含血清培養液中Fe@CNP-TMAEA，Fe@CNP-Imi.，Fe@CNP-AA刺激後48小時之各細胞狀態比例 (n=3) ...........................................................58
表4-5 不同重量比之DNA/Fe@CNP-Imi. Cpx. 餵入HeLa cell後各細胞狀態比例(n=3).............................................................................................................68

                                

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