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研究生： 蔡傑次
Jie-Tsi Tsai
論文名稱： 明膠支架孔洞大小及培養條件對於組織工程軟骨形成的影響
Effect of pore size and culturing conditions of gelatin scaffold on the formation of tissue engineered cartilage
指導教授： 黃大仁
Ta-Jen Huang
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 工學院 - 化學工程學系
Department of Chemical Engineering
論文出版年： 2008
畢業學年度： 96
語文別： 中文
論文頁數： 101
中文關鍵詞： 組織工程 、軟骨 、明膠 、孔洞大小 、醣胺素
外文關鍵詞： Gelatin, Cartilage, Tissue Engineering, Mechanical test, C6S, Pore size
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    • 本實驗為應用組織工程概念，製作明膠支架在體外培養關節軟骨細胞。明膠是膠原蛋白變性(denatured)產物，是常見的生醫材料，如傷口貼布、藥物載體等。但其機械強度不足是用於製作支架的缺點，故本實驗室使用槴子花提煉的天然交聯劑-genipin，改善此項缺陷。為了增進支架孔洞連通性，我們利用二次冷凍乾燥增加孔壁上的小孔，使細胞在遷移和培養液的分布更加均勻。
    本實驗室也已證實明膠支架的確是一適合培養軟骨細胞的支架，且發現支架的孔洞大小會影響細胞增生、貼附及分泌ECM等行為，我們改變冷凍的溫度可製作700-1000μm到50-150μm孔洞大小的支架，藉此觀察孔洞大小對軟骨細胞生長的影響。
    另ㄧ方面，本實驗也觀察培養環境對軟骨細胞的影響，例如添加醣胺素C6S直接培養軟骨細胞，發現直接添加培養有很大的幫助。

    第一章 緒論 1 第二章 文獻回顧 3 2-1 骨關節炎(退化性關節炎) 3 2-2 軟骨組織學 6 2-2-1 軟骨組織生理結構 6 2-2-2 軟骨的分類 8 2-2-3 關節軟骨構造 .10 2-2-4 膠原蛋白與多醣 12 2-2-4-1 膠原蛋白(Collagen) 12 2-2-4-2 蛋白多醣(Proteoglycan) 14 2-2-4-3 醣胺素(Glycosaminglycan) 14 2-2-5細胞外間質受器 16 2-3 關節軟骨治療 18 2-4 組織工程 21 2-4-1支架.....................................................................................................24 2-5 明膠 28 第三章 研究規劃 30 第四章 實驗方法與步驟 33 4-1 明膠支架製作 33 4-1-1 不同反應溫度下的支架製作(含二次冷凍乾燥流程) 33 4-2 支架特性分析 34 4-2-1 支架結構SEM觀察 34 4-2-2 支架降解率分析 34 4-2-3支架機械抗壓力測試 35 4-2-3-1支架單次壓力測試 35 4-2-3-2支架多次壓力測試 36 4-3 軟骨細胞培養 37 4-3-1 支架前處理 37 4-3-2 小鼠軟骨細胞分離與植入支架 37 4-4 定性分析 39 4-4-1 組織切片染色 39 4-5 定量分析 40 4-5-1 DNA assay 40 4-5-2 GAG assay 41 4-5-3 空支架吸光值校正 42 4-5-4 real-time PCR反應 42 4-5-4-1細胞RNA萃取 42 4-5-4-2 RNA定量 43 4-5-4-3反轉錄聚合酶連鎖反應 44 4-5-4-2 real-time PCR反應………………………………………….44 第五章 實驗結果與討論 45 5-1 支架結構製作法 45 5-1-1 先成膠再交聯法 45 5-1-2交聯溶液的pH値影響 45 5-1-3 交聯溫度的影響 46 5-1-4 交聯時間 46 5-1-5 冷凍時間 46 5-1-6 冷凍乾燥 47 5-1-7 冷凍溫度 47 5-1-8 支架結構比較 48 5-2 支架特性分析 52 5-2-1 支架結構SEM觀察 52 5-2-2實驗組與對照組SEM觀察…………………………………………53 5-3 -20℃冷凍製程支架培養細胞實驗 55 5-3-1 GAG assay & DNA assay 55 5-3-2 組織切片觀察 58 5-3-2-1 H&E stain橫切面 58 5-3-2-2 H&E stain縱切面 62 5-3-3 real-time PCR 64 5-4 添加醣胺素C6S之培養實驗 68 5-4-1 醣胺素與軟骨細胞的關聯 68 5-4-2 DNA assay & GAG assay 69 5-4-3 實驗組與對照組切片比較圖 71 5-4-3-1 H&E STAINING 71 5-4-3-2 SAFRANIN-O STAINING 72 5-4-4 real-time PCR比較………………………………………………….75 5-4-4-1實驗組與對照組在各週的結果…………………………….75 5-4-4-2 以各週為單位時間比較對照組實驗組的結果……………77 5-5 -20℃冷凍製程支架之機械性質 80 5-5-1 支架機械性質模擬 80 5-5-2 濕潤空支架機械強度測試 80 5-5-2-1 單次壓縮 80 5-5-2-2 多次壓縮 82 5-5-2-3 培養3週後的支架壓力測試 85 5-5-3支架降解實驗 89 5-5-3-1 降解的變因 89 5-5-3-2 降解結果................................................................................90 第六章 結論 91 第七章 參考文獻…………………………………………………………………. ..93 第八章 附錄…………………………………………………………………………97 圖目錄 圖 2 1 骨關節炎進化圖……………………………………………………………...5 圖 2 2 軟骨組織圖…………………………………………………………………...7 圖 2 3 軟骨分類圖…………………………………………………………………...9 圖 2 4 關節軟骨結構……………………………………………………………….11 圖 2 5 醣胺素分佈位置圖………………………………………………………….15 圖 2 6 醣胺素結構圖……………………………………………………………….15 圖 2 7 軟骨組織外間質細部圖…………………………………………………….17 圖 2 8 常見關節治療圖…………………………………………………………….20 圖 2 9 組織工程示意圖…………………………………………………………….23 圖 2 10 明膠與GP交聯之程序……………………………………………………29 圖 3 1 實驗流程規劃……………………………………………………………….32 圖 4 1Qubit florometer RNA定量buffer配製圖…………………………………..43 圖 5 1 -20℃冷凍之SEM結構圖 …………………………………………………..52 圖 5 2冷凍溫度改變下SEM對照圖………………………………………………54 圖 5 3孔洞大小近似兩組SEM對照圖……………………………………………54 圖 5 4 -20℃冷凍製程支架GAG assay…………………………………………….55 圖 5 5 -20℃冷凍製程DNA assay………………………………………………….56 圖 5 6二週支架100X H&E 橫切染色圖…………………………………………58 圖 5 7二週支架200X H&E 橫切染色圖…………………………………………59 圖 5 8三週支架100X H&E 橫切染色圖…………………………………………60 圖 5 9三週支架200X H&E 橫切染色圖…………………………………………61 圖 5 10二週支架100X H&E 縱切染色圖………………………………………..62 圖 5 11三週支架100X H&E 縱切染色圖 ………………………………………..63 圖 5 12二週細胞培養real-time PCR分析圖……………………………………...64 圖 5 13三週細胞培養real-time PCR分析圖………………………………………65 圖 5 14 C6S實驗組與對照組的DNA ASSAY…………………………………….69 圖 5 15 C6S實驗組與對照組的GAG ASSAY…………………………………….70 圖 5 16 C6S實驗組與對照組H&E stain圖……………………………………….72 圖 5 17 C6S實驗組與對照組Safranin-O stain圖…………………………………73 圖 5 18實驗組real-time PCR圖……………………………………………………75 圖 5 19對照組real-time PCR圖.…………………………………………………..76 圖 5 20第二週對照組與實驗組real-time PCR比較圖……………………………77 圖 5 21第三週對照組與實驗組real-time PCR比較圖……………………………78 圖 5 22第四週對照組與實驗組real-time PCR比較圖……………………………79 圖 5 23-20℃冷凍製程進行單次壓力測試(下圖含標準差)……………………….81 圖 5 24-80℃冷凍製程進行單次壓力測試(柯良諭學長數據)………………….....81 圖 5 25支架多次壓縮測試圖………………………………………………………82 圖5-26支架Plateau region curve……………………………………………………83圖5-27支架培養3週後的機械應力比較………………………………………….85 圖5-28 細胞培養3週後支架與浸泡培養液3週空支架的機械應力比較圖，由上而下25℃、20℃、15℃、10℃……………………………………………………..87 圖5-29 空支架與培養30天支架機械應力測試，於形變50%的比較圖（n=3）….87 圖1 30 軟骨組織不同部位的受力形變程度………………………………………88 圖5-31 支架降解實驗結果圖………………………………………………………89 表目錄 表格 5 1個反應溫度組別製作支架細節…………………………………………..46 表格 5 2變因控制表………………………………………………………………..48 表格 5 3改變冷凍溫度結果表……………………………………………………..49 表格 5 4單位細胞各週分泌的GAG量……………………………………………57 表格 5 5 第二週與第三週各基因的P值比較…………………………………….66 表格 5 6添加C6S實驗條件………………………………………………………..68 表格 5 7 支架壓縮水平區域出現之形變位置…………………………………….83 表格 5 8支架經過壓力測試之厚度恢復率………………………………………..84

    1. Ranieri Cancedda, Beatrice Dozina, Paolo Giannonia, Rodolfo Quartob, Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone. Matrix Biology 22 (2003) 81–91
    2. 柯良諭 改良式明膠支架之特性及其用於組織工程軟骨培養之研究 清華大學化工系 碩士論文 民國96年
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    4. 李偉德 明膠作為關節軟骨組織工程支架對軟骨細胞生長的影響 清華大學化工系 碩士論文 民國94年
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    6. 劉峻幗 複合式生醫陶瓷支架上關節軟骨細胞行為的研究 清華大學化工系 碩士論文 民國94年
    7. 簡千翔 明膠與陶瓷複合式支架培養關節軟骨細胞的研究 清華大學化工系 碩士論文 民國95年
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    第3章第八章 附錄
    9-1 實驗儀器與設備
    1.恆溫循環水槽, water bath, COCONO,BH-100
    2.低溫恆溫循環水槽, water bath, DENG YNG D-610
    3.旋轉震盪儀, orbital shaker, FIRSTEK S-101
    4.-80℃冰箱, freezer, Thermo Forma -86C ULT freezer
    5.-20℃冰箱, frezzer, 東元冰箱
    6.冷凍乾燥機, frozen dryer, 今銘實業FDZ-6P-M
    7.高溫高壓滅菌鍋, speedy autoclave, TOMIN TM-327
    8.無菌操作台,laminar flow hood,造鑫 VCM-4、VCM-620
    9.烘箱, convection oven, COCONO DK-500
    10.電磁式攪拌器, magnetic stirrer, Fargo MS-90
    11.精密電子天平, balances, Precisa XB 220A
    12.試管震盪器, vortex, VORTEX GENIE 2
    13.光學顯微鏡, microscope, OLYMPUS TM-327
    14.掃描式電子顯微鏡, scanning electron microscope, JEOL JSM-5600
    15.電子防潮箱, dry cabinet, 高強AD 68
    16.無菌培養箱, CO2 incubator, REVCO 3000
    17.酸鹼度測量儀, pH meter, SUNTEX SP-701
    18.手動式幫浦, manual pomp, MITYVAC
    19.電動式吸管, pipet-aid, FALCON &EXPRESS
    20.微量分注器, electronic pipettes, NICHIRYO Nichipet EX
    21.多爪微量分注器, multichannel pipettes, ORANGE SCIENTIFIC TIPOR-M
    22.離心機, centrifuge, DIGISYSTEM DSC-156SHDT
    23.螢光光譜分析儀, fluorescence spectrophometer, HITACHI F-2500
    24.酵素免疫微盤分析儀, ELSA reader, SUNRISE TECAN
    25.萬能材料試驗機, instron, INSTRON 5543
    26.玻璃試管乾浴加熱器, dry bath incubator, Major Science
    27.超高速離心機, ultracentrifuge, HerMLE Z 300K, HerMLE
    28.PCR System, GeneAmp PCR System 9700,ABI
    29.RNA定量系統, QubitTM florometer, invitrogen

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