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研究生： 陳惠美
論文名稱： 陽離子型高分子微胞之合成與性質之研究
Studies of the Preparation and Characterization of Cationic Polymeric-Micelle
指導教授： 李育德
口試委員:
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 工學院 - 化學工程學系
Department of Chemical Engineering
論文出版年： 2004
畢業學年度： 92
語文別： 中文
論文頁數： 121
中文關鍵詞： 基因載體 、陽離子型高分子微胞 、兩性高分子 、基因轉殖
外文關鍵詞： carrier, cationic polymeric micelle, gene therapy, transfection
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    • 高分子材料用作基因載體可避免病毒型載體的安全性及免疫問題，將外界正常基因傳送到人體目標細胞，做持續性的釋放，讓基因能長期表現，進行基因修補，改正基因缺陷或抑制異常的基因，進而達到治療目的，由於兩性高分子及陽離子型高分子都是可用做基因載體的高分子材料，本研究選用親水性高、穩定不會快速分解且生物相容性高的甲氧基聚乙二醇（Poly(glycol)methyl ether）及具疏水性及生物相容性的環己內酯（ε- caprolactone）共聚合形成具有酯鍵（ester）官能基的兩性高分子，以期達到生物可分解性的目標，並且利用不同方式將兩性高分子末端改質成具胺基（amine）的高分子，成為陽離子型基因載體，經由生物測試比較材料的對細胞毒性及基因轉殖。

    摘要..............................................................................Ⅰ 目錄..............................................................................Ⅱ 第一章 緒論..................................................................1 第二章 理論與文獻回顧..............................................4 2-1 【基因治療】..............................................................................4 2-1-1 發展歷史.....................................................................4 2-1-2 原理.............................................................................7 2-1-3 目前應用的疾病.......................................................11 2-1-4 實施方法...................................................................15 2-2 【基因載體】............................................................................19 2-2-1 病毒型載體.............................................................. 19 2-2-1.1 反轉錄病毒載體............................................19 2-2-1.2 慢病毒載體....................................................21 2-2-1.3 腺病毒載體....................................................21 2-2-1.4 腺相關病毒載體............................................22 2-2-1.5 皰疹病毒載體................................................23 2-2-1.6 賽門病毒載體................................................24 2-2-1.7 牛乳狀瘤病毒載體........................................24 2-2-2 非病毒型載體...........................................................25 2-2-2.1 脂質體載體....................................................25 2-2-2.2 ＤＮＡ直接注射............................................27 2-2-2.3 基因槍............................................................29 2-2-2.4 高分子載體....................................................30 2-3 【Polymeric Micelle】..............................................................38 第三章 實驗動機........................................................41 第四章 實驗部分........................................................42 4-1 【實驗藥品】..............................................................................42 4-2 【實驗儀器】.............................................................................44 4-3 【實驗方法與流程】................................................................45 4-3-1 兩性高分子之合成...................................................46 4-3-2 兩性高分子化學改質...............................................48 4-3-3 兩性高分子接枝改質...............................................51 4-4 【化學分析鑑定方法】............................................................53 4-4-1兩性高分子之性質分析與組成鑑定........................53 4-4-2兩性高分子化學改質鑑定........................................55 4-4-3兩性高分子接枝改質鑑定........................................57 4-5 【Gene transfection及生物性質測定】...................................59 4-5-1 Amplification of plasmid DNA…..............................59 4-5-2 Cytotoxicity : MTT……………………....................61 4-5-3 Agarose Gel Retardation Assay..................................62 4-5-4 Transfection.............................................................64 第五章 結果與討論....................................................65 5-1 兩性高分子分析與鑑定 65 5-2 化學改質高分子分析與鑑定 87 5-3 接枝改質高分子分析與鑑定 96 5-4 Gene transfection及生物性質測定 105 第六章 結論..............................................................117 第七章 參考文獻......................................................119 圖目錄 圖2- 1 基因治療圖示 7 圖2- 2 全球基因治療研發現況 14 圖2- 3 基因治療實施方法 16 圖2- 4 Mechanisms of drug release from the micelle 35 圖2- 5 Pluronic block copolymers 36 圖2- 6 Structure and transfection efficiency of PEI 36 圖2- 7 Structure of PLL and PAGA 37 圖2- 8 Transfection efficiency and toxicity of PLL and PAGA 37 圖2- 9 兩性高分子微胞化過程 38 圖4- 1 實驗流程圖 45 圖4- 2 兩性高分子合成之流程 46 圖4- 3 Moffatt Oxidation 48 圖4- 4 Conversion of function group 49 圖4- 5 Chemical coupling 51 圖5- 1 FT-IR spectrum of mPEG-PCL 65 圖5- 2 1:35.5 (A) 500MHz 1H-NMR spectrum of mPEG-PCL 67 圖5- 3 1:25 (B) 500MHz 1H-NMR spectrum of mPEG-PCL 68 圖5- 4 1:20 (C) 500MHz 1H-NMR spectrum of mPEG-PCL 69 圖5- 5 1:10 (D) 500MHz 1H-NMR spectrum of mPEG-PCL 70 圖5- 6 1:5 (E) 500MHz 1H-NMR spectrum of mPEG-PCL 71 圖5- 7 1:35.5 (A) CMC by UV of mPEG-PCL 75 圖5- 8 1:25 (B) CMC by UV of mPEG-PCL 76 圖5- 9 1:20 (C) CMC by UV of mPEG-PCL 77 圖5- 10 1:10 (D) CMC by UV of mPEG-PCL 78 圖5- 11 1:5 (E) CMC by UV of mPEG-PCL 79 圖5- 12 1:35.5 (A) CMC by FL of mPEG-PCL 80 圖5- 13 1:25 (B) CMC by FL of mPEG-PCL 81 圖5- 14 1:20 (C) CMC by FL of mPEG-PCL 82 圖5- 15 1:10 (D) CMC by FL of mPEG-PCL 83 圖5- 16 1:5 (E) CMC by FL of mPEG-PCL 84 圖5- 17 FT-IR spectrum of Conversion of function group 88 圖5- 18 500MHz 1H-NMR spectrum of mPEG-PCLA 90 圖5- 19 500MHz 1H-NMR spectrum of mPEG-PCLN-A 91 圖5- 20 ESCA of mPEG-PCLN-A 92 圖5- 21 FT-IR spectrum of Chemical Coupling 97 圖5- 22 500MHz 1H-NMR spectrum of mPEG-PCL-COOH 99 圖5- 23 500MHz 1H-NMR spectrum of mPEG-PCLN-B 100 圖5- 24 ESCA of mPEG-PCLN-B 101 圖5- 25 Agarose Gel Retardation Assay of GFP plasmid DNA 105 圖5- 26 MTT Assay (1000μg/ml，three days) figure ………..107 圖5- 27 MTT Assay (3500μg/ml，one day) figure 109 圖5- 28 mPEG-PCL、mPEG-PCLN-A/-B電泳圖 111 圖5- 29 mPEG-PCLN-B電泳圖 112 圖5- 30 mPEG-PCLN-A/-B電泳圖 113 圖5- 31 cells after transfection 115、116 表目錄 表2 - 1 Cationic Homopolymers Studied as Gene Carriers 32 表2 - 2 Cationic Copolymers Studied as Gene Carriers 33 表2 - 3 Ligands Used with CPs for Targeting of Genes 34 表4 - 1 實驗藥品..................................................................................42 表4 - 2 兩性高分子聚合之配方表......................................................47 表5- 1 mPEG-PCL 500MHz 1H-NMR spectrum之化學位移………..66 表5- 2 500MHz 1H-NMR組成鑑定…………….…………………….72 表5- 3 MW of mPEG-PCL....................................................................73 表5- 4 CMC of mPEG-PCL..................................................................74 表5- 5 DLS analysis of mPEG-PCL......................................................86 表5- 6 ESCA analysis of Conversion of function group.......................94 表5- 7 EA analysis of Conversion of function group............................95 表5- 8 ESCA analysis of Chemical Coupling……….........................103 表5- 9 EA analysis of Chemical Coupling…………..........................104 表5- 10 MTT Assay (1000μg/ml，three days) data…........................107 表5- 11 MTT Assay (3500μg/ml，one day) data…............................109 表5- 12 圖5- 28之各well所代表的樣品…......................................111 Scheme目錄 Scheme 4- 1 實驗流程圖 45 Scheme 4- 2 兩性高分子合成之流程 46 Scheme 4- 3 Moffatt Oxidation 48 Scheme 4- 4 Conversion of function group 49 Scheme 4- 5 Simple coupling 51

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